植物における精密ゲノム編集技術ジーンターゲッティングの効率化

植物精准基因组编辑技术：提高基因打靶效率

• 批准号: 21K05535
• 负责人: 横井 彩子
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: National Agriculture and Food Research Organization
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K05535/
• 关键词: ジーンターゲッティング; ゲノム編集; DNA修復; テロメア; イネ; DNA修復機構

ゲノム編集技術の一つであるジーンターゲッティング（GT）は、DNA修復経路の一つである相同組換えを介して標的遺伝子を望み通りに改変できるため、植物の基礎研究や作物育種の加速化に非常に重要な技術である。代表者はこれまで、広範な作物種に適用できる汎用的GT系を確立するためにGT効率の簡便な評価システムを構築し、GT効率を向上させる化合物処理や鋳型配列のデリバリー系の開発を行ってきた。その中で、Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) 阻害剤処理や分割型Transferred DNA (T-DNA) でGTの鋳型配列をデリバリーすることによってGT効率を向上できることを明らかにしてきた。そこで本課題では、これら2つのアプローチによりGT効率が向上する現象のメカニズムを解明し、その知見からGT実験系のファインチューニングを行い、更なる高効率化とより実効性のある実験系の確立を目指す。令和4年度は、PARP阻害剤処理によるGT効率向上の機構を明らかにすることを目的として、昨年度CRISPR/Cas9システムにより作製したOsPARP1およびOsPARP2Aノックアウトイネを用いて、T-DNA挿入頻度の解析を行うとともに、野生型イネカルスのPARP阻害剤処理がT-DNA挿入頻度に及ぼす影響も解析した。また、PARPの阻害により相同組換え効率が向上するかどうかを評価するため、レポーターの発現により相同組換え効率を簡便に評価できるレポーター系を導入したイネ系統を確立した。分割型T-DNAによる鋳型デリバリーがGT効率を向上させる機構を明らかにするため、分離型および一体型GTベクターを用いて昨年度に作出したGT個体を用いてDroplet Digital PCR（ddPCR）により鋳型コピー数の解析を行った。

基因靶向（GT）是一种基因组编辑技术之一，是基本植物研究和加速作物育种的非常重要的技术，因为它允许通过同源重组（DNA修复途径之一）根据需要修改靶基因。该代表先前已经构建了一个简单的GT效率评估系统，以建立可以应用于广泛的农作物物种的通用GT系统，并开发了一种用于治疗化合物和模板序列递送系统以提高GT效率的系统。在这项研究中，我们揭示了可以通过处理聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抑制剂并使用分裂转移DNA（T-DNA）的GT模板序列来提高GT效率。因此，在这个主题中，我们将阐明通过这两种方法提高GT效率的现象的机制，并且基于此知识，我们将对GT实验系统进行微调，进一步提高效率并建立更有效的实验系统。在2022年，为了阐明通过治疗PARP抑制剂提高GT效率的机制，我们分析了使用OSPARP1和OSPARP2A敲除水稻去年使用CRISPR/CAS9系统制备的T-DNA插入的频率，并分析了PARP抑制剂对T-DNA插入频率的效果。此外，为了评估PARP的抑制是否提高同源重组效率，建立了水稻菌株，该菌株引入了一个记者系统，该系统可以通过表达记者的表达来轻松评估同源重组效率。为了澄清使用分型T-DNA的模板交付的机制提高了GT效率，我们使用去年使用独立和集成的GT载体创建的GT个体使用Droplet Digital PCR（DDPCR）分析了模板拷贝数。