ヒトメガサテライトDNAのゲノム構造と超可変性

人类巨卫星 DNA 的基因组结构和高变异性

基本信息

批准号：
12024231
负责人：
権藤洋一
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

世代間10%という超可変性を示すヒト4p15領域に存在するRS447メガサテライトDNAは単位長4746bpのタンデム反復配列構造をもつ。単位長内には1590bpからなるORF様配列があり脱ユビキチン化酵素と高い相同性を示す。RS447相同配列はサル、ウシ、ウサギ、イヌ、ブタ、チャイニーズハムスター、ラットにも存在し、イヌ、マウス以外ではタンデム反復構造も示唆された。チャイニーズハムスターやラットよりも、マウスDUB-1、DUB-2の方が、ヒトRS447配列と高い相同性を示したが、マウスにおいては顕著なタンデム反復構造はない。本年度は、ヒトRS447反復配列の生物学的機能、とくにその中のORFにコードされている脱ユビキチン化酵素様の配列について検討した(Saitoh et al.,Genomics)。RNA blotting解析を行った結果、心臓、脳、肝、骨格筋に約2.4kbの転写産物が認めらた。想定される開始コドンの-89のGが転写開始塩基とわかった。また+2367と+2388が3′端と推定されpolyA付加サイトも+2321、+2362にそれぞれ存在している。転写長は2.47kbとなり、RNA blottingの結果と一致した。プロモーター活性解析の結果、-179から-143に必須な配列を同定した。この領域には逆向きのCAATボックスがあり、実際にCATCに置換すると転写活性が失われた。ちなみにTATAボックスは確認できない。ORFによってコードされる530残基ペプチドには、脱ユビキチン化酵素共通のCysドメイン、Hisドメイン領域がよく保存性されている。ヒト遺伝子命名法ガイドラインに沿ってこのペプチドをUSP17と名付けた。E.coliで発現させたUSP17は、実際に、T7タッグをつけたユビキチン化GFPを脱ユビキチン化した。しかし、CysドメインのCys-89をSerに置換したUSP17(S89)ではこの脱ユビキチン化は起こらなかった。以上より、RS447ORFにコードされるUSPは脱ユビキチン活性を持つことが証明された。

人类4P15区域中存在的RS447兆阳性岩DNA在世代之间表现出10％的极限性，具有串联重复序列结构，单位长度为4746 bp。在单位长度内，有一个像ORF一样的序列，由1590 bp组成，并显示出与去泛素酶的高同源性。 RS447同源序列也存在于猴子，母牛，兔子，狗，猪，中国仓鼠和大鼠中，建议除狗和小鼠以外的串联重复结构。小鼠DUB-1和DUB-2与中国仓鼠和大鼠相比，与人RS447的序列显示出更高的同源性，但是小鼠没有明显的串联重复结构。今年，我们研究了人类RS447重复序列的生物学功能，尤其是由ORF编码的去泛素酶样序列（Saitoh等人，基因组学）。 RNA印迹分析显示，心脏，大脑，肝脏和骨骼肌中大约2.4 kb的转录本。发现预期的启动密码子-89的G是转录启动基础。此外，估计+2367和+2388在3'端，并且+2321和+2362也存在polya添加的位点。转录长度为2.47 kb，与RNA印迹的结果一致。启动子活性分析揭示了-179至-143的基本序列。该区域有一个倒置的CAAT盒，当实际用CATC替换时，转录活动就会丢失。顺便说一句，我无法检查塔塔框。由ORF编码的530个残留肽具有保存良好的CYS结构域及其域区域，共有去泛素酶。根据人类基因命名法指南，该肽被命名为USP17。 USP17在大肠杆菌中表达，实际上用T7标签去泛素化的泛素化GFP。但是，这种去泛素化并未发生在USP17（S89）中，其中CYS-89在CYS域中被SER替换。从以上，已证明由RS447orf编码的USP具有去泛素活性。