DNA組換えにおけるRuvA,B,Cタンパクの機能解析

DNA 重组中 RuvA、B 和 C 蛋白的功能分析

基本信息

批准号：
04262205
负责人：
品川日出夫
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至 1992
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04262205/
关键词：
RuvAタンパク RuvBタンパク RuvCタンパク ruvA遺伝子 ruvB遺伝子 ruvC遺伝子 DNA組換え Holliday構造

项目摘要

遺伝学的研究によって、大腸菌のruvA,ruvB,ruvC遺伝子の産物は相同的DNA組換えの後期温程に関与すると考えられている。私達は前年度迄の研究の結果、RuvAとRuvBタンパクは複合体を形成して組換え中間体であるHolliday構造の移動を促進する機能をもつという仮説をたて、本年度の研究によってこの仮説を証明した。又RuvCはHolliday構造を切断して組換え体を分離する特異的なエンドヌクレアーゼであることを前年度に証明したが、本年度は更にRuvCの性質を化学的に解析した。1.RuvAとRuvBタンパクは各々4量体と2量体を形成し、この比率で、両者は安定な複合体を水溶液中で形成することを証明した。2.合成DNAを用いて、Holliday構造のアナログである十字型DNAを作成し、RuvAがHolliday構造に特異的に結合する性質をもつ、RuvBはこの結合能を促進することを証明した。3.RuvA-RuvB複合体は十字型DNAに結合して、ATPの存在下で二重鋭DNAを巻きもどして分離する活性(Holliday構造特異的ヘリケス)をもつことを発見した。4.RuvA-RuvB複合体は、RecAタンパクによって形成されたHolliday構造に作用して、ATP分解のエネルギーを利用してHollidy junctianの移動させる(branch migration)活性をもつことを証明した。5.種々の構造をもつDNAを作成して、RubCは十字型およびY型DNAに特異的に結合するが、切断するためには中央のコア部分にホモロジーが存有することが必要であることが示された。6.RuvCのエンドヌクレアーゼ活性の至適pHは6〜9で、2価金属イオンが活性に必須で、高濃度の1価の金属塩は阻害的であることを明らかにした。

遗传学研究表明，大肠杆菌ruvA、ruvB和ruvC基因的产物参与同源DNA重组的后期阶段。根据去年的研究结果，我们推测RuvA和RuvB蛋白形成复合体，具有促进重组中间体霍利迪结构运动的功能，今年的研究证实了这一假设。。此外，我们在前一年证明了RuvC是一种特异性核酸内切酶，可以切割Holliday结构并分离重组体，今年我们进一步对RuvC的性质进行了化学分析。 1. 我们证明了 RuvA 和 RuvB 蛋白分别形成四聚体和二聚体，并且以这种比例它们在水溶液中形成稳定的复合物。 2.使用合成DNA，我们创建了十字形DNA，它是Holliday结构的类似物，并证明RuvA具有与Holliday结构特异性结合的特性，并且RuvB促进了这种结合能力。 3. 我们发现RuvA-RuvB复合物具有与十字形DNA结合并在ATP存在下解旋和分离双尖DNA的活性（Holliday结构特异性螺旋）。 4.我们证明RuvA-RuvB复合物作用于RecA蛋白形成的Holliday结构，并利用ATP分解的能量具有Hollidy结体的分支迁移活性。 5.我们创建了具有各种结构的DNA，发现RubC特异性结合十字形和Y形DNA，但同源性必须存在于中央核心区域才能裂解它。 6.我们发现RuvC核酸内切酶活性的最适pH为6至9，二价金属离子对其活性至关重要，高浓度的单价金属盐具有抑制作用。