DNA組換えにおけるRuvA、B、Cタンパクの機能解析

DNA 重组中 RuvA、B 和 C 蛋白的功能分析

基本信息

  • 批准号:
    05255205
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.92万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
  • 财政年份:
    1991
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1991 至 1993
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

相同的DNA組換えは集団の中で遺伝的多様性をもたらす役割と共に、損傷を受けたDNAの組換えによる修復に重要な役割を果たしている。本研究によって、これまでにRuvAとRuvBは複合体を形成し、組換え中間体であるHolliday構造に特異的に作用して、単鎖DNAの交換反応を促進して、ヘテロ二重鎖を形成させ、RuvCがHolliday構造交差点を切断して組換え体を分離し、DNAリガーゼが切断末端を再結合させて、組換え反応を完了させることを生化学的研究によって明らかにしてきた。更にruvA、BおよびruvC株を紫外線照射して培養すると、染色体の分離が起こらず、非常に長い細胞になる(1-2時間)。更に培養する(3-4時間)と、無核の短い細胞を分離する。このことは、損傷を受けた二本のDNA同士が組換え中間体であるHolliday構造を形成するが、ruv遺伝子の機能が欠けているため分離できなくなるためと考えられる。この結果は、RuvA・B・Cタンパクがin vivoにおいてHolliday構造の分離に関与していることを支持している。Holliday構造のアナログとして種々の形状のDNA(十字型、Y字型、線状2本鎖、それらの中央にパリンドローム配列をもつもの等)を合成DNAを用いて作成し、RuvCによる結合と切断反応を調べた。その結果RuvCは十字型DNAと強く結合するが、その切断にはパリンドローム配列をもって、交差点の移動が可能な十字型DNAのみを切断することが明かになった。RuvCはHolliday構造に非常に特異性の高いエンドヌクレアーゼであることが証明された。RuvCエンドヌクレアーゼの活性中心を解明すべく、多数のruvC遺伝子の突然変異を分離して、それらの塩基配列を決定した。その結果、複数のアスパラギン酸が活性中心を形成していることが明らかになった。
同源 DNA 重组在实现群体遗传多样性以及通过重组修复受损 DNA 方面发挥着重要作用。这项研究表明,RuvA 和 RuvB 形成复合物,并特异性作用于重组中间体 Holliday 结构,促进单链 DNA 的交换反应并形成异源双链体。生化研究表明,RuvC 裂解 Holliday 结构。交叉以分离重组体,DNA连接酶重新连接切割末端以完成重组反应。此外,当ruvA、B和ruvC菌株在紫外线照射下培养时,不会发生染色体分离并且细胞变得很长(1-2小时)。进一步孵育(3-4小时)后,分离短无核细胞。这被认为是因为两条受损的DNA形成Holliday结构,该结构是重组中间体,但由于ruv基因功能的缺失而无法分离。这一结果支持 RuvA、B 和 C 蛋白参与体内 Holliday 结构的分离。作为Holliday结构的类似物,使用合成DNA创建了各种DNA形状(十字形、Y形、线性双链、中心有回文序列的DNA等),并通过RuvC进行结合和切割我检查了反应。结果表明,RuvC 与十字形 DNA 强烈结合,但仅切割具有回文序列的十字形 DNA,并允许交叉点移动。 RuvC 被证明是 Holliday 结构的高度特异性核酸内切酶。为了阐明RuvC核酸内切酶的活性中心,我们分离出了RuvC基因中的大量突变并测定了它们的核苷酸序列。结果表明多个天冬氨酸形成活性中心。

项目成果

期刊论文数量(6)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Hideo Shinagawa: "Frontiers of Photobiology(Elsevier,Amsterdam)" Shima,A.,Ichihashi,M.,Fujiwara,Y.,and Takebe,H., 7 (1993)
品川秀夫:“光生物学前沿(爱思唯尔,阿姆斯特丹)” Shima, A.、Ichihashi, M.、Fujiwara, Y. 和 Takebe, H.,7 (1993)
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
Masahiko Takahagi: "Structural requirements of substrate DNA for binding to and cleavage by RuvC,a Holliday junction resolvase" J.Biol.Chem.(in press). (1994)
Masahiko Takahagi:“底物 DNA 与霍利迪连接体解酶 RuvC 结合和切割的结构要求”J.Biol.Chem.(出版中)。
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
Toshikazu Shiba: "Escherichia coli RuvA and RuvB proteins involved in recombination repair:physical propeerties and interactions with DNA." Mol.Gen.Genet.237. 395-399 (1993)
Toshikazu Shiba:“大肠杆菌 RuvA 和 RuvB 蛋白参与重组修复:物理特性以及与 DNA 的相互作用。”
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
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    品川 日出夫

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知道了