クロマチンリモデリングに関与するヘリカーゼによる転写調節ネットワーク

参与染色质重塑的解旋酶的转录调控网络

• 批准号: 13206050
• 负责人: 河野 憲二
• 金额: $ 2.56万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13206050/
• 关键词: RuvBタンパク質; クロマチンリモデリング; ヘリカーゼ; 転写調節; マイクロアレイ; TBP

RVB2/TIH2の高温感受性株を利用し、また酵母DNAマイクロアレイ法を用いることにより、RVB2/TIH2依存的に転写調節を受ける遺伝子群を網羅的に探索した。マイクロアレイを行った結果、Rvb2p/Tih2pが不活化すると転写が抑制されるもの、逆に転写が促進される遺伝子群があり、転写が抑制されるものの多くはΔino80でも転写が抑制されていた。一方転写が促進される遺伝子群はΔino80とは挙動を共にしなかった。これらの結果をノザン解析を行うことにより確認した。この結果から、RVB複合体はIno80複合体に含まれ転写を制御している場合と、Ino80とは別の形で転写を制御している場合とがあることが予想された。免疫共沈降実験により、Rvb2p/Tih2pとRvb1p/Tih1pとは複合体を形成していることがわかったが、さらにGST-RVB融合タンパク質を作製し、GST pull-down実験を行うことにより、Rvb1pとRvb2pとが直接結合している可能性が高いことが明らかとなった。また、同様な免疫沈降実験によりRVB複合体とTBPとは相互作用していることが判明した。TBPとRVB2との2重変異株を作製すると、29℃での細胞の生育ができなくなる合成効果がみとめられ、両者が遺伝的にも関連していることが裏付けられた。面白いことに、この効果はTBPのアレルに特異的であり、その部位とRVB複合体とが相互作用している可能性がでてきた。現在、RVB複合体に含まれる個々のタンパク質を、MALDI-TOFを用いて解析しており、新しいタンパク質が同定されつつある。今後は、これらのタンパク質が転写制御にどのような役割を持つかを調べるとともに、標的遺伝子が明らかになったので、その転写制御に実際にRVB1/TIH1,RVB2/TIH2が関わっているのかどうかを種々の方法で確認していきたい。

使用酵母DNA微阵列法的高温敏感性菌株，经过了经过RVB2/TIH2依赖性转录调控的基因组。由于微阵列的结果，当RVB2P/TIH2P被灭活时，有一些基因被抑制，另一方面，有一些基因促进转录，并且在大多数情况下，即使在ΔIno80中，转录也会抑制。另一方面，促进转录的基因群与Δino80并没有表现。通过进行北方分析证实了这些结果。该结果预测RVB复合物可以包含在INO80复合物中，并且可以控制转录，也可以控制与Ino80不同形式的转录。共免疫沉淀实验表明，RVB2P/TIH2P和RVB1P/TIH1P形成了复杂，但是通过进一步准备GST-RVB融合蛋白并进行GST下拉实验，可以发现RVB1P和RVB2P很有可能直接结合。此外，类似的免疫沉淀实验表明，RVB复合物和TBP相互作用。创建TBP和RVB2的双重突变菌株显示出一种合成作用，可防止在29°C下细胞生长，证实两者在遗传上相关。有趣的是，这种效果是特定于TBP等位基因的，并且该站点和RVB复合物可能相互作用。当前，正在使用MALDI-TOF分析RVB复合物中包含的单个蛋白质，并正在鉴定新蛋白质。将来，我们将研究这些蛋白质在转录调控中的作用，我们还将能够确定靶基因是否实际上使用各种方法参与转录调控。

项目成果

Y.Fujioka, Y.Kimata, K.Nomaguchi, K.Watanabe, K.Kohno: "Identification of a novel non-SMC component of the SMC5/SMC6 complex involved in DNA repair"Journal of Biological Chemistry. 277(In press). (2002)

Y.Fujioka、Y.Kimata、K.Nomaguchi、K.Watanabe、K.Kohno：“鉴定参与 DNA 修复的 SMC5/SMC6 复合物的新型非 SMC 成分”生物化学杂志。