毒素受容体を介した標的細胞ノックアウト法の開発

开发毒素受体靶细胞敲除方法

• 批准号: 14658272
• 负责人: 河野 憲二
• 金额: $ 2.5万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14658272/
• 关键词: 細胞ノックアウト法; ジフテリア毒素; HB-EGF; 肝炎モデル; 糖尿病モデル; 膵臓β細胞; 疾患モデルマウス; 標的細胞ノックアウト法; 肝炎モデルマウス

1 人工毒素受容体の作製:増殖因子活性を失い且つ毒素結合活性を維持している変異型毒素の作製を行った。DT(ジフテリア毒素)とHB-EGF(毒素受容体)とが結合した状態の3次構造は明らかにされており、結合に重要なアミノ酸やその領域(EGF相同領域)も明らかにされている。逆にEGFやTGFの研究により、どのアミノ酸が変異すると増殖因子としての活性を失うかも報告されている。これらの情報を総合的に判断し蛋白質立体構造をシミュレートすることにより、純粋毒素受容体を得るために必要なアミノ酸変異部位候補をしぼり、そのアミノ酸について部位特異的変異を導入した。具体的にはHB-EGFの5種のアミノ酸(I117,V124,R128,Y138,L148)を種々のアミノ酸に置換した変異のうち、ほぼ増殖因子活性を失ったものとして、Y138D,Y138L,L148Vの3種が、ま.た3分の1程度に低下したものとして、I117V,I117A,V14Fの3種が明らかとなった。この中でさらに毒素受容体活性を測定した結果、野生型と同様の活性を有している変異が3種(I117V,I117A,L148V)、1桁感受性が低下している変異が2種(Y138L,V124F)あることが判明した。昨年行ったプロテアーゼ耐性型のL148S/P149T HB-EGFについても現在検討中である。2 本法が肝細胞以外にも使えるかどうかを明らかにするため、インスリンプロモーター下流にHB-EGFをつないだtransgeneを作製し、膵臓ランゲルハンス島β細胞に毒素受容体を発現するトラシスジェニックマウスを作製した。これらのマウスに毒素を投与することによりβ細胞を破壊し、糖尿病が引き起こされるかどうかを確かめている。現在毒素投与により血中のグルコース濃度が顕著に上昇することが観察されており、狙い通り毒素により糖尿病を引き起こしている可能性が高いと考えている。

1。人工毒素受体的产生：产生了损失生长因子活性并维持毒素结合活性的突变毒素。已经揭示了DT（白喉毒素）和HB-EGF（毒素受体）的三级结构，并且也揭示了氨基酸及其区域（EGF同源区域），这对于结合也很重要。相反，对EGF和TGF的研究还报告说，哪种氨基酸突变将失去其活性作为生长因素。通过全面确定这些信息并模拟蛋白质构象，滑动了获得纯毒素受体所需的候选氨基酸突变位点，并引入了针对氨基酸的位置指导突变。 Specifically, among the mutations in which five amino acids of HB-EGF (I117, V124, R128, Y138, L148) are replaced with various amino acids, it has been revealed that three species, Y138D, Y138L, and L148V, have been reduced to about a third of the mutations, I117V, I117A, and V14F, have been found to have almost生长因子活性损失。此外，测量了毒素受体活性，发现有三个突变（I117V，I117A，L148V），其活性与野生型相似，两个突变（Y138L，V124F）具有一个数量级的敏感性。我们目前还正在考虑去年我们执行的抗蛋白酶的L148/P149T HB-EGF。 2为了确定除肝细胞以外的其他方法是否可以使用这种方法，通过将HB-EGF连接到胰岛素启动子的下游来制备转基因，以及在胰岛胰岛中表达毒素受体的Trasisgenic小鼠Langerhans langerhansβ细胞。毒素对这些小鼠的施用会破坏β细胞，并旨在确定是否引起糖尿病。目前，已经观察到，由于毒素的给药，血糖水平显着升高，并且毒素可能会导致糖尿病。

项目成果

Sano, H.: "Conditional ablation of striatal neuronal types containing dopamine D2 receptor disturbs coordination of basal ganglia function."J.Neuroscience. 23. 9078-9088 (2003)

Sano, H.：“含有多巴胺 D2 受体的纹状体神经元类型的有条件消融会扰乱基底神经节功能的协调。”J.Neuroscience。

Kiso, S.: "Liver regeneration in heparin-binding EGF-like growth factor transgenic mice after partial hepatectomy."Gastroenterology. 124. 701-707 (2003)

Kiso, S.：“部分肝切除术后肝素结合 EGF 样生长因子转基因小鼠的肝脏再生。”胃肠病学。

Kiso, S.: "Liver regeneration in heparin-binding EGF-like growth factor transgenic mice after partial hepatectomy"Gastroenterology. 124. 701-707 (2003)

Kiso, S.：“部分肝切除术后肝素结合 EGF 样生长因子转基因小鼠的肝脏再生”胃肠病学。