GPI側鎖の生合成機構及びその生理的意義の解明

阐明GPI侧链的生物合成机制及其生理意义

基本信息

批准号：
16H06939
负责人：
平田哲也
金额：
$ 1.91万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2016
资助国家：
日本
起止时间：
2016-08-26 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーは糖脂質による蛋白質の翻訳後修飾である。哺乳動物細胞のGPIには、種間で保存された基本構造に、さらにN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)から始まる糖鎖が側鎖として付加され、申請者はGalNAc側鎖合成に必須なGPI-GalNAc転移酵素(PGAP4と命名)をクローニングした。本研究は、1)PGAP4の機能に必要なパートナー分子の探索、2)PGAP4のGPI認識機構の解明、3)GPI側鎖の生理的意義の解明を目的とした。1)のために、マウス神経芽腫細胞株のNeuro2A細胞を用いた順遺伝学的スクリーニングを計画していた。しかし、予備的な実験により、PGAP4は単独でも機能しうることが示唆されたため、予定していたスクリーニングは実施しなかった。2)のために、PGAP4のアミノ酸配列を基に三次元立体構造モデルの作製を試みた。その結果、バクテリアのセルロース合成酵素を鋳型としてモデルを構築することができた。PGAP4は酵素活性ドメインと膜直上領域でGPIの糖鎖部位と結合し、膜貫通領域でGPIの脂質部位と結合することが示唆された。作成したモデルとセルロース合成酵素の立体構造を重ね合わせることで、PGAP4の活性中心と、供与基質である糖ヌクレオチドとの結合部位を見出した。この成果により、GPIにGalNAc側鎖が付加される詳細な分子メカニズムが明らかとなり、現在学術論文の投稿を計画している。3)のために、発生工学研究センターと共同で、PGAP4のアレルにEGFPをノックインしたPGAP4ノックアウトマウスを作製した。ノックアウトマウスはメンデルの法則に従って生まれてきた。EGFPを指標にPGAP4の組織発現分布を調べたところ、脳で強い発現が見られた。現在、理化学研究所のバイオリソースセンターと共同で表現系の解析に取り組んでいる。

糖基磷酸乙醇（GPI）锚固是通过糖翻译蛋白质后的一种修饰。将哺乳动物细胞的GPI添加到存储在物种之间的基本结构中，而从N-乙酰乳糖苷（GalNAC）开始的糖链被添加为侧链，并且申请人对于GalNAC侧链合成至关重要克隆转移酶（名为PGAP4）。这项研究是探索1）PGAP4功能所需的伴侣分子，2）阐明了PGAP4的GPI识别机制，并阐明了GPI侧链的生理意义。对于1），我们计划在小鼠神经发芽细胞中使用Neuro2a细胞进行一种基因筛查。但是，初步实验没有执行预定的筛查，这表明PGAP4可以单独使用。对于2），我们试图基于PGAP4的氨基酸序列创建一个三维三维结构模型。结果，该模型能够使用细菌纤维素合成酶作为模具构建模型。 PGAP4被提出，酶活性结构域与膜区域正上方的GPI糖链位点结合，并建议它与膜穿透区域的GPI的脂质位点结合。通过与纤维素合成酶的三维结构重叠，我们在PGAP4的活动中心和糖nkleotide（是提供的底物）之间找到了一个连接位点。该结果揭示了一种详细的分子机制，该机制为GPI增加了Galnac的侧链，目前正计划发布学术论文。对于3），与发生的工程研究中心合作创建了在EGFP中敲入EGFP到PGAP4的PGAP4敲除小鼠。淘汰老鼠是根据门德尔定律诞生的。当使用EGFP作为指数检查PGAP4组织表达分布时，在大脑中看到了强烈的表达。目前，我们正在与Riken研究所合作进行与表达相关系统的分析。

项目成果

期刊论文数量（3）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Jiangnan University/Ministry of Education/School of Biotechnology(中国)

江南大学/教育部/生物技术学院（中国）

DOI：
发表时间：
期刊：
影响因子：
0
作者：
通讯作者：

立体構造モデルに基づいたGPI-GalNAc転移酵素PGAP4によるGPI側鎖合成機構

基于3D结构模型的GPI-GalNAc转移酶PGAP4合成GPI侧链的机制

DOI：
发表时间：
2016
期刊：
影响因子：
0
作者：
平田哲也;Sushil Kumar Mishra;中村昇太 ;元岡大祐 ;神澤範行 ;藤田盛久;村上良子 ;前田裕輔 ;山口芳樹;木下タロウ
通讯作者：
木下タロウ

The mechanism for the addition of GPI side-chain by PGAP4, a GPI-GalNAc transferase, predicted from its 3D model

从 3D 模型预测 PGAP4（一种 GPI-GalNAc 转移酶）添加 GPI 侧链的机制

DOI：
发表时间：
2016
期刊：
影响因子：
0
作者：
Tetsuya Hirata;Sushil Kumar Mishra;Shota Nakamura;Daisuke Motooka;Noriyuki Kanzawa;Morihisa Fujita;Yoshiko Murakami;Yusuke Maeda;Yoshiki Yamaguchi;Taroh Kinoshita
通讯作者：
Taroh Kinoshita