cyclic ADP-ribose合成・分解酵素の活性発現に必須な一次構造の解明

阐明环状 ADP-核糖合成/降解酶活性表达所必需的一级结构

• 批准号: 07680644
• 负责人: 那谷 耕司
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07680644/
• 关键词: CD38; cyclic ADP-ribose; ADP-ribosyl cyclase; cyclic ADP-ribose hydrolase; 細胞内情報伝達物質; カルシウムイオン; site-directed mutagenesis; クローニング

研究代表者らが新しく見出した細胞内情報伝達物質cyclic ADP-ribose (cADPR)は、リンパ球の表面抗原であるCD38により合成・分解される。本研究の目的は、cADPR合成・分解酵素(CD38)の活性発現に必須な一次構造を明らかにすることである。平成7年度の研究計画は、計画どおりに進行し、以下の様に期待された成果が得られた。1.ヒト、ラット、マウスのCD38のアミノ配列および研究代表者らが決定したアメフラシのcADPR合成酵素のアミノ酸配列(Gene158, 213-218, 1995)を比較した結果、アメフラシ酵素に存在する10個のシステイン(Cys)がCD38でも保存されていた。この10個のCys以外にCD38間ではさらに2個のCysが保存されており、アメフラシ酵素ではこれら2個のCysに対応する配列はリジン(Lys)とグルタミン酸(Glu)であることが明らかとなった。2.研究代表者らはすでにヒトインスリノーマ由来のRNAを鋳型にしたPCR法によりヒトCD38 cDNAを、アメフラシ卵精巣のcDNAライブラリーよりcADPR合成酵素のcDNAを単離しているので、CD38およびアメフラシ酵素のcDNAの1.で同定した領域に、site-directed mutagenesisの手法を用いて変異を導入した。3.変異を導入したCD38およびアメフラシ酵素のcDNAをpSV2ベクターに組み込んだ後COS-7細胞に導入して、変異を持った酵素をCOS-7細胞に発現させた。4.ウェスタンブロット法により、変異cDNAを導入したCOS-7細胞中に酵素タンパクが発現していることを確認した。5.^<32>Pで標識したNADおよびcADPRを基質に、AG-MP1カラムを用いたHPLC法でcADPRの減少とADP-riboseの増大を指標にして、変異cDNAを導入したCOS-7細胞のホモジェネート中の酵素活性を測定した。その結果、CD38でのみ保存されている2個のCysをそれぞれLys, Gluに変異させたCD38はcADPR分解活性を失い、合成活性のみを示した。またアメフラシ酵素のLys, GluをどちらもCysに変異させると、アメフラシ酵素はcADPR合成活性に加えて分解活性も有するようになった。(Diabetes 1994, 244-246, 1995)6.研究代表者らはヒトCD38遺伝子を単離しその構造及び染色体座位を決定した(Cytogenetics and Cell Genetics, 69, 38-39, 1995)が、その結果ヒトCD38遺伝子からは選択的スプライシングによって上記の2個のCysを欠く変異体が生じることが明らかになった。この変異体のcDNAをCOS-7細胞に発現させたところ、cADPR合成・分解活性は認められなかった。以上の結果から、CD38の2個のCysがcADPR合成・分解活性に必須であることが明らかになった。

研究代表新发现的细胞内信号物质环ADP-核糖（cADPR）是由淋巴细胞表面抗原CD38合成并降解的。本研究的目的是阐明 cADPR 合成/降解酶 (CD38) 活性表达所必需的一级结构。 1995年的研究计划按计划进行，取得了预期成果如下。 1. 比较人、大鼠、小鼠 CD38 的氨基酸序列和研究代表确定的海兔 cADPR 合酶的氨基酸序列 (Gene158, 213-218, 1995)，发现 10 个氨基酸海兔酶半胱氨酸（Cys）中存在的酸在 CD38 上也保守。除了这10个Cys之外，CD38中还有两个Cys是保守的，并且已经揭示海兔酶中这两个Cys对应的序列是赖氨酸(Lys)和谷氨酸(Glu)。 2.主要研究人员已经使用人胰岛素瘤来源的RNA作为模板通过PCR分离了人CD38 cDNA，并且使用定点诱变将来自海兔卵睾cDNA文库的突变引入到步骤1中鉴定的cDNA区域。 3.将突变的CD38和海兔酶的cDNA插入pSV2载体，然后导入COS-7细胞中以在COS-7细胞中表达突变的酶。 4.通过Western印迹证实酶蛋白在导入了突变体cDNA的COS-7细胞中表达。 5.使用32 P标记的NAD和cADPR作为底物并使用HPLC方法，使用AG-MP1柱作为cADPR减少和ADP-核糖增加的指示剂，用突变体cDNA转染COS-7细胞中的酶活性。测量匀浆。结果，仅在CD38中保守的两个Cys分别突变为Lys和Glu的CD38失去了cADPR降解活性并且仅显示合成活性。此外，当海兔酶的Lys和Glu都突变为Cys时，海兔酶除了具有cADPR合成活性之外还能够分解cADPR。 (Diabetes 1994, 244-246, 1995) 6. 主要研究人员分离了人类CD38基因并确定了其结构和染色体位点(Cyto Genetics and Cell Genetics, 69, 38-39, 1995)；揭示了缺乏该基因的突变体；上述两个Cys是由CD38基因通过选择性剪接产生的。当该突变体cDNA在COS-7细胞中表达时，没有观察到cADPR合成/降解活性。上述结果表明CD38的两个Cys对于cADPR的合成和降解活性至关重要。

项目成果

Hideto Yonekura: "Identification of the five essential histidine residues for peptidylglycine monooxygenase." Biochem. Biophys. Res. Commum.218. 495-499 (1996)

Hideto Yonekura：“肽基甘氨酸单加氧酶的五个必需组氨酸残基的鉴定。”

Hiroshi Okamoto: "Diabetes 1994" Shigeki Baba and Toshio Kaneko, 244-246 (1995)

Hiroshi Okamoto：“糖尿病 1994” Shigeki Baba 和 Toshio Kaneko，244-246 (1995)

東郷 暁: "ATPは直接CD38に作用してcyclic ADP-ribose分解活性を抑制する" 糖尿病. 39 (in press). (1996)

Akira Togo：“ATP 直接作用于 CD38 以抑制环 ADP-核糖降解活性”糖尿病 39（出版中）。

古谷保人: "ラットcyclic ADP-ribose合成酵素関連遺伝子産物BST-1の構造と発現" 生化学. 67. 697-697 (1995)

Yasuto Furuya：“大鼠环ADP核糖合酶相关基因产物BST-1的结构和表达”生物化学67. 697-697 (1995)。

加藤一郎: "ペプチドC末端アミド化酵素:ペプチジルグリシンモノオキシナーゼとリアーゼin“新しい酵素研究法"" 一島英治、小野寺一清(東京化学同人), 85-91 (1995)

加藤一郎：“肽C末端酰胺化酶：‘新酶研究方法’中的肽酰甘氨酸单加氧酶和裂合酶”市岛英二，小野寺一清（东京化学同人），85-91（1995）