cyclic ADP-ribose合成・分解酵素の基質と調節因子の結合部位の決定

环ADP-核糖合成/降解酶底物结合位点和调节因子的测定

基本信息

批准号：
09780559
负责人：
東郷暁
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09780559/
关键词：
cyclic ADP-ribose second messenger CD38 ADP-ribosyl cyclase cyclic ADP-ribose hydrolase

项目摘要

cyclic ADP-ribose(cADPR)は申請者らがインスリン分泌のセンカンドメッセンジャーとして新しく見出した細胞内情報伝達物質である。申請者らはまた、cADPRの合成・分解酵素の実体はCD38であり、CD38のcADPR分解酵素活性はATPによって抑制されることを明らかにしている。従って、cADPR合成・分解の調節機構を分子レベルで理解するためには、cADPR合成・分解酵素の基質(NAD、cADPR)と調節因子(ATP)の結合部位を同定することが重要であると考えられる。平成10年度の研究は当初計画どおり進行し、以下のような成果が得られた。平成9年度にはNAD、cADPR、ATPに共通するadenosine部分の類似体である5'-p-fluorosufonyl-benzoyladenosine(FSBA)で標識したCD38のエンドペプチダーゼ消化断片から、FSBA-ペプチド断片を同定した。そこで、1.同定したペプチド断片のアミノ酸配列をペプチド-クエンサーを用いて決定したところ、CD38の129番目のリジン(Lys129)がFSBA結合部位であることが明らかとなった。2.Lys129をアラニンまたはアルギニンに変異させたCD38を精製した。抗FSBA抗体を用いたウェスタン法の結果、これらの変異CD38はFSBAと結合しないことが明らかとなった。3.ゲル濾過カラムを用いてCD38のcADPRとの結合活性の検討を行ったところ、これらの変異CD38はcADPRと結合しないことが明らかとなった。4.酵素学的な検討を行なったところ、これら変異型CD38はcADPR分解活性を消失したが、NADを基質とするcADPR合成活性は保持されていた。従って、Lys129がcADPRとATPの共通の結合部位であることから、ATPがLys129でcADPRと競合的に作用することによりCD38のcADPR分解活性を抑制すると考えられた。

环状ADP-ribose（CADPR）是申请人新发现为胰岛素分泌的Senkand Messenger的细胞内信息发射器。申请人还指出，CADPR合成和降解酶是CD38，并且CD38 CADPR降解酶的活性被ATP抑制。因此，为了了解分子水平的CADPR合成和分解的调整机制，重要的是要识别底物（NAD，CADPR）与CADPR合成 /降解酶（ATP）之间的连接位点（ATP）（ATP）（ATP）（ATP）（ATP） ATP）。最初计划了这项研究，并获得了以下结果。 1997年，从5'p-fluorosufonyl-苯甲酰丙烯胺（FSBA）中鉴定出FSBA肽片段从CD38 CD38的端肽酶消化片段中鉴定出来，这是NAD，CADPR和ATP的腺苷部分相似的腺苷部分的类似物体。因此，当使用肽审查确定已鉴定的肽片段的氨基酸序列时，发现CD38的第129赖氨酸（Lys129）是FSBA结合位点。 2。CD38已被突变为alginin或精氨酸，被纯化。由于使用抗-FSBA抗体的西方方法，这些突变CD38与FSBA没有结合。 3。使用凝胶过滤柱对CD38 CADPR进行结合活性的检查表明，这些突变体CD38与CADPR没有结合。 4。进行一项酶研究时，这些突变的CD38在CADPR分解活性中消失了，但是基于NAD的CADPR合成活性得到了维持。因此，由于LYS129是CADPR和ATP之间的共同联系，因此人们认为ATP在Lys129中积极用CADPR积极作用，以抑制CD38的CDPR分解活性。