CD63関連遺伝子クローニングとその蛋白機能解析

CD63相关基因克隆及蛋白功能分析

• 批准号: 05670095
• 负责人: 西堀 正洋
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05670095/
• 关键词: Granulophysin; CD63; 血小板; トランスメンブレン4; 線維芽細胞

我々は止血異常を主徴とする体性劣性遺伝疾患Hermansky-Pudlack症候群で著明に低下している血小板濃染顆粒膜蛋白質Granulophysinを精製し、この蛋白質がCD63と同一蛋白であると結論した。本年度の研究では、CD63と構造的に類似する新しいgene family(トランスメンブレン4)のcDNAクローニングを試みた。ヒト白血球、ヒト脳、ヒトneuroblastomaよりmRNAを精製し、逆転写酵素によりcDNAを合成し、PCRの鑄型とした。CD63及び関連蛋白の膜貫通領域I、IIをコードする以下の混合primerを合成した。各鑄型を用いてPCR反応を行ったところ185-240bpに数本のバンドが認められた。ヒト脳から得られた195bpのfragmentをpCRIIに組み込み、サブクローニングし、塩基配列を決定したが得られたクローンはこれまでのところCD63の配列とすべて一致した。現在、他の大きさのfragmentのシークエンスを試みている。一方、人胎児線維芽細胞培養上清に抗granulophysinモノクローナル抗体を8〜40μg/ml添加し、細胞形態・細胞増殖に対する効果をみたが、現在までのところ有意の変化は認められていない。

我们纯化了颗粒蛋白，一种血小板染色的颗粒蛋白，在体细胞隐性遗传疾病Hermansky-Pudlack综合征中大大降低，主要由止血异常引起，并得出结论，该蛋白与CD63是相同的蛋白质。今年的研究试图将新基因家族的cDNA克隆（跨膜4）在结构上与CD63相似。从人白细胞，人脑和人神经母细胞瘤中纯化mRNA，并使用逆转录酶合成cDNA形成PCR笼。合成了编码CD63和相关蛋白质的跨膜区域I和II的以下混合引物。当使用每种类型的笼子进行PCR反应时，发现在185-240 bp处发现了几个条带。从人脑获得的195 bp片段被掺入PCRII，亚克隆，并确定了碱基序列，但所得的克隆都与迄今为止CD63的序列匹配。目前，我们正在尝试对其他尺寸的片段进行测序。另一方面，将8-40μg/ml的抗粒细胞单克隆抗体添加到人类胎儿成纤维细胞的上清液中，尽管观察到对细胞形态和细胞增殖的影响，但迄今未观察到重大变化。