脳由来の新しいセルピン様蛋白質の構造と機能に関する研究

一种新型脑源性丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构与功能研究

基本信息

批准号：
06670114
负责人：
西堀正洋
金额：
--
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06670114/
关键词：
セルピンプロテアーゼアストログリアニューロン

项目摘要

牛脳ホモジネートの上清画分から、熱処理、イオン交換クロマト、ゲル濾過等の操作によって新しいSerpin(B-43)を精製した。精製蛋白は分子量43kD、等電点5.3-5.4で、部分アミノ酸配列は他のSerpin family 蛋白と高い相同性を有していた。B-43はヘパリンアフィニティカラムには結合せず、同じく脳から精製されているProtease nexin-1とはヘパリン親和性において異なっていることがわかった。また標的プロテアーゼの検索のために行ったプロテアーゼとの結合実験では、ウシトロンビン、ブタエラスターゼ、ヒトプラスミン、ヒトウロキナーゼといずれもSDS安定性の複合体を形成しなかった。従って現在のところ、標的プロテアーゼの性質については不明である。得られた内部アミノ酸配列からヌクレオチドプライマーを合成し、PCR反応によりcDNAフラグメントを得た。得られたシークエンスは,Serpinに共通するアミノ酸配列を含んでおり、目的とするフラグメントであると考えられた。これをプローブとして、牛脳cDNAライブラリーをscreeningし、ほぼ全長をコードするクローンが得られたので現在、シークエンスを行っているところである。一方、B-43に対するウサギポリクローナル抗体によって細胞局在について検討したところ、ウシ大脳皮質、海馬、線条体小脳のGFAP陽性アストログリア細胞が陽性細胞として同定された。その陽性突起はしばしば血管壁まで追跡することができた。また大脳皮質第VI層錐体細胞、線条体ニューロン、海馬CAI、CA2領域に多数陽性神経細胞が存在した。これらの結果はB-43が、アストログリア、神経細胞の両方の機能に関与することを示唆する重要な知見である。

通过热处理，离子交换色谱，凝胶过滤等，从牛脑匀浆的上清液中纯化了新的Serpin（B-43）。纯化的蛋白质的分子量为43 kD，等电点为5.3-5.4，部分氨基酸序列与其他SERPIN家族蛋白高度同源。 B-43不与肝素亲和力柱结合，并且发现与蛋白酶nexin-1不同，这也从大脑中纯化。此外，在对蛋白酶进行搜索靶蛋白酶的结合实验中，牛凝血酶，猪弹性酶，人纤溶酶或人尿激酶均不构成具有SDS稳定的复合物。因此，目前，靶蛋白酶的性质尚不清楚。从获得的内部氨基酸序列合成核苷酸引物，并通过PCR反应获得cDNA片段。所得序列包含SERPIN共有的氨基酸序列，被认为是感兴趣的片段。使用它作为探针，我们筛选了牛脑cDNA库，并获得了几乎整个长度的克隆，因此我们目前正在进行测序。另一方面，当使用兔多克隆抗体对B-43进行检查时，将牛大脑皮层中的GFAP阳性星形胶质细胞，海马和纹状体小脑鉴定为阳性细胞。正预测通常被追溯到容器壁。此外，许多阳性神经元存在于大脑皮层，纹状体神经元，海马CAI和CA2区域的VI层锥体细胞中。这些结果是重要的发现，表明B-43参与了星形胶质细胞和神经元功能。