ラフトを定量的に解析する方法の開発と応用

筏定量分析方法的开发及应用

基本信息

批准号：
17659053
负责人：
藤本豊士
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

膜脂質は膜構造のベースとなるだけでなく,ミクロドメインの形成,シグナル伝達など多様な機能を持つ.しかし脂質分子は通常の化学固定剤とは反応せず,また仮に反応したとしても時間がかかるため,脂質分子の正確な超微局在を従来の免疫電顕法で捉えることはほとんど不可能である.我々はSDS処理凍結割断レプリカ標識法(SDS-FRL)を基礎技術として用い,膜脂質の局在をnmレベルで定量的に捉えることを目指している.本研究では脂質ラフトのマーカーとして用いられるGM1について下記の結果を得た.正常マウス線維芽細胞ではGM1は半径47nm程度のクラスターを形成して分布していた.このことはRipleyのK関数を用いた点過程解析によって確かめられた.メチルβシクロデキストリンによるコレステロール除去,あるいは氷温,30分の浸漬により,クラスター形成の程度は顕著に低下し,ランダムに分布する領域がしたが,クラスター形成領域も残存した.またこれらの処理により,GM1の標識密度は有意に増加し,最近隣距離も増大した.最近隣距離は無処理群では標識密度によってほとんど変化しなかったが,コレステロール除去群,低温処理群では標識密度が大きくなると減少した.これらの結果は無処理細胞ではGM1がクラスターを作り,2つの処理により分散傾向を示すと考えることによって説明できる.モデル実験の結果,レプリカ上に固定される膜脂質の割合(保持効率)および標識されるGM1の割合(標識効率)はそれぞれ82.6%,19.4-27.7%であり,細胞膜に存在する脂質を非常に高い効率で補足していることが確かめられた.この方法は他の膜脂質にも応用可能であり,今後に多くの展開が期待できる.

膜脂质不仅是膜结构的基础，而且具有多种功能，例如微区域的形成和信号传导。但是，脂质分子不会与常规化学固定剂反应，即使它们反应，它们也需要时间，因此几乎不可能使用常规的免疫电子显微镜准确捕获脂质分子的超细定位。我们使用SDS-FRL作为一种基本技术，目的是定量捕获NM水平的膜脂质的定位。在这项研究中，我们获得了GM1的以下结果，GM1用作脂质筏的标记。在正常小鼠成纤维细胞中，GM1分布在半径约为47 nm的簇中。使用Ripley的K函数通过点过程分析证实了这一点。用甲基β-环糊精或在冰温下浸入30分钟的胆固醇去除胆固醇。簇的形成程度显着降低，尽管存在随机分布的区域，但簇形成区域也仍然存在。这些处理显着增加了GM1的标记密度和最近的邻居距离。由于未经处理的组的标记密度，最近的邻居距离几乎不会改变，但是当胆固醇缓解组和低温治疗组的标记密度增加时，邻居的距离降低。可以通过考虑GM1在未处理的细胞中创建簇，并通过两种治疗表现出分散趋势来解释这些结果。模型实验表明，固定在复制品（保留效率）上的膜脂质的比例和标记GM1（标记效率）的比例分别为82.6％和19.4-27.7％，并且证实了在细胞膜中存在的脂质具有很高的效率。该方法可以应用于其他膜脂质，并且将来可以预期许多发展。