がん細胞の増殖,浸潤機構と脂質ドメイン

癌细胞增殖、侵袭机制与脂质结构域

基本信息

批准号：
20013018
负责人：
藤本豊士
金额：
$ 9.41万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

膜脂質の正確な局在をナノメートルレベルで決定することは膜生物学だけでなく,細胞増殖,細胞運動など種々の現象を分子レベルで理解するために重要である。しかし,通常の化学固定剤は脂質に作用せず,また様々な刺激が局在変化を惹起する可能性があるため,膜脂質に関する理解は進んで来なかった。我々は今回の研究により急速凍結と凍結割断レプリカ標識法を組み合わせることにより,膜脂質を物理的に固定し,局在を決定する方法を開発した。その方法を用いて,細胞骨格,小胞輸送などの制御に重要な役割を果たすフォスファチジルイノシトール4,5二燐酸(PIP2)の挙動を明らかにした。PIP2は線維芽細胞の平坦な膜領域ではごく弱いクラスターを形成するのみであったが,カベオラ開口部,コーテッドピット辺縁部には高度な集中を示した。Angiotensin II刺激後,平坦な膜領域では10秒でPIP2標識密度は最低レベルに低下し,2分までに徐々に回復した。カベオラのPIP2は10秒では変化せず,40秒で最も低下し,2分で静止期レベルに回復した。コーテッドピットは10秒でやや減少したが,その程度は平坦な膜領域に比較してごく軽度であった。PIP2の集合は,カベオラではカベオリンに,コーテッドピットではepsin, dynaminなどのエンドサイトーシス関連蛋白質に結合することによって生じると考えられる。今回の結果は,3つの異なる挙動を示すPIP2のプールが形質膜に存在することを明確に示した。本研究で開発した方法は高い空間解像度を持ち,任意の細胞に応用することができる。動物体内の細胞など,多くの実験系への応用が考えられ、癌細胞の挙動解析にも重要なツールとなる。

在纳米水平上确定膜脂的精确定位不仅对于膜生物学很重要，而且对于在分子水平上理解细胞增殖和细胞运动等各种现象也很重要。然而，我们对膜脂的认识并没有取得进展，因为常见的化学固定剂不作用于脂质，各种刺激会引起局部变化。在这项研究中，我们开发了一种物理固定膜脂并通过结合快速冷冻和冷冻断裂复制标记来确定其定位的方法。利用这种方法，我们阐明了磷脂酰肌醇 4,5 二磷酸 (PIP2) 的行为，它在调节细胞骨架和囊泡运输中发挥着重要作用。 PIP2仅在成纤维细胞的平膜区域形成微弱的簇，但高度集中在小窝开口和包被的小凹边缘。血管紧张素II刺激后，平膜区域PIP2标记密度在10 s内降至最低水平，并在2 min后逐渐恢复。小凹的PIP2在10 s时没有变化，在40 s时下降最大，并在2 min时恢复到稳定期水平。 10秒后，涂覆的凹坑略有减少，但与平膜区域相比，程度非常轻微。 PIP2 组装被认为是通过与小凹中的小凹蛋白结合以及与包被凹坑中的内吞作用相关蛋白（例如蛋白酶和动力蛋白）结合而发生的。我们的结果清楚地表明质膜中存在三个具有不同行为的 PIP2 库。本研究开发的方法具有高空间分辨率，可以应用于任意细胞。它可以应用于许多实验系统，例如动物体内的细胞，也将成为分析癌细胞行为的重要工具。