アンチセンスオリゴDNA筋肉内投与による筋ジストロフィー遺伝子治療に関する研究

反义寡DNA肌肉注射治疗肌营养不良症基因治疗的研究

基本信息

批准号：
09770545
负责人：
竹島泰弘
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

【背景】ジストロフィン遺伝子の欠失により、mRNA上での欠失している領域の塩基数が3の倍数でない場合(out-of-frame)Duchenne型筋ジストロフィー(DMD)となるが、3の倍数(in-frame)であるとより軽症なBecker型筋ジストロフィー(BMD)となる。申請者は先にエクソン19内に存在するエクソン認識配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオテド(AS-oligo)によりスプライシングの過程においてエクソンをスキッピングさせることか可能であることをin vitro、および培養細胞の系において明らかにした。このことを臨床に応用することができると、DMDの症例の欠失領域に隣接する1ないし数個のエクソンを、AS-oligoによりmRNA上から消失させ、欠失領域をin-frameに変え、表現型をDMDよりBMDに変更することが可能である。このような臨床応用を考える上での基礎研究として、DMD症例より得られた培養細胞にAS-oligoを導入し、その効果を検討する。【方法】ジストロフィン遺伝子エクソン20の欠失を有するDMD症例より得られたリンパ芽球様細胞培養系に、エクソン19内に存在するエクソン認識配列に対するAS-oligoをリポフェクチン法によって導入し、スプライシングに及ぼす効果を検討する。【結果および考察】ジストロフィン遺伝子エクソン20の塩基数は242塩基でout-of-frameであるため、本症例はDMDの臨床像を呈する。エクソン19つ内に存在するエクソン認識配列に対するAS-oligoを導入した後ジストロフィンmRNAを解析したところ、エクソン19のスキッピングを誘導することが可能であった。従ってmRNA上における欠失は88塩基(エクソン19)と242塩基(エクソン20)で330塩基となっており、BMDの臨床像を呈するin-frameの欠失へと変換することが可能であった。このことは、AS-oligoによるエクソンスキッピングの誘導により、mRNAレベルにおいてDMD型のout-Of-frameの欠失からBMD型のin-frameの欠失へ変換することが可能であることを示している。今後、筋組織の培養細胞系を用いて、蛋白レベルでの検討を行なっていく予定である。

背景：肌营养不良蛋白基因的缺失会导致Duchenne肌肉营养不良（DMD），而mRNA上删除区域的碱基的数量不是3个（未框架）的倍数，但是如果它是3个（框架内），则贝克尔肌肉肌肉症（BMD）更为轻度。申请人先前在体外和培养细胞中证明了在用反义寡核苷酸（AS-Oligo）剪接过程中可以跳过外显子与外显子识别序列中存在的外显子识别序列。框架，表型可以从DMD更改为BMD。作为考虑此类临床应用的基本研究，将AS-Oligo引入从DMD病例获得的培养细胞中，并将检查此类效果。方法：外显子19中存在的外显子识别序列上的As-Oligo通过LipoFectin方法引入了从DMD病例获得的淋巴细胞细胞培养系统中，该系统从DMD病例中获得，并研究了椎间盘突出症基因20的缺失，并研究了旋转效果。 [结果和讨论]因为肌营养不良蛋白基因20的基本数量为242个碱基，并且是框架之外，因此这种情况呈现出DMD的临床图片。 After introducing AS-oligo for the exon recognition sequences present in exon 19, dystrophin mRNA was analyzed, it was possible to induce skipping of exon 19. Therefore, the deletion on the mRNA was 330 bases with 88 bases (exon 19) and 242 bases (exon 20), allowing it to be converted to an in-frame deletion that presents a clinical presentation of BMD.这表明通过AS-Oligo跳过外显子可以将DMD型的不框架缺失转换为mRNA级别的BMD型固件缺失。将来，我们计划使用来自肌肉组织的培养细胞系在蛋白质水平上进行研究。