遺伝子治療を目指した膜透過・チャンネル形成ペプチドのベクターとしての可能性

膜穿透和通道形成肽作为基因治疗载体的潜力

• 批准号: 14771267
• 负责人: 和田 俊一
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Osaka University of Pharmaceutical Sciences
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14771267/
• 关键词: ペプチドベクター; アンチセンスオリゴヌクレオチド; 遺伝子治療; ペプチド; オリゴヌクレオチド; ベクター

遺伝子治療における遺伝子導入ベクターの開発を目的として本研究を行なった.1.ペプチドベクターのデザインと合成,アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)の細胞内導入の検討チャンネル形成,膜透過機能を有する部位と静電的にオリゴヌクレオチドと結合する塩基性リンカー部位をデザインし,7種類のペプチド(P-1〜P-7)をFmoc固層合成法で合成した.P-1:Ac-U-N-I-I-U-P-L-L-U-P-I-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-OH;P-2:Ac-U-N-I-I-U-P-L-L-U-P-I-NH(CH_2)_2N(CH_3)_2;P-3:Ac-U-U-U-U-U-U-U-U-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-OH;P-4:Ac-U-U-U-U-U-U-U-U-P-K-S-K-R-K-V-OH;P-5:Ac-U-U-U-U-U-U-U-U-G-NH(CH_2)_2N(CH_3)_2;P-6:Ac-U-A-U-A-U-A-Q-U-L-U-G-U-U-P-V-U-B-E-Q-F-NH(CH_2)_2N(CH_3)_2;P-7:Ac-U-A-U-A-U-A-Q-U-L-U-G-U-U-P-V-U-B-E-Q-F-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-OH.蛍光ラベル化-AON/ペプチドを種々のモル比でプレインキュベーションし複合体を形成させ,AON/ペプチド複合体をNIH3T3,A549細胞に投与した.37℃,2hrインキュベーションした後,共焦点レーザー顕微鏡でAONの細胞内移行性及び細胞内分布を,フローサイトメーターで導入率を検討した.また,AON/ペプチド複合体の細胞毒性を乳酸脱水素酵素(LDH)の漏出を測定することにより行なったNIH3T3細胞では,AON/PI=1/10〜1/15の間で,AON/P7=1/10でLDHの漏出なしにAONの膜透過性が認められ,細胞質,核への分布が観察された.しかし導入率の点においては,リポソームベクターであるlipofectamineより低かった.またこの現象は,エンドサイトーシスが抑制される低温条件下でもAONの膜透過性が観察された.他のペプチドにおいては,AONの膜透過性は認められなかった.一方,A549細胞においては,すべてのペプチドで細胞毒性のない範囲内でのAONの細胞内への移行が観察されなかった.2.物理化学的手法を用いたAON透過機構の解明AON透過機構解析の基礎的な知見として,溶液中,リポソーム中でのP1,P7のコンフォメーション解析をCDスペクトルを用いて検討した.溶液中においては,両ペプチドともランダムコイル状態,一方リポソーム中ではヘリックス構造に変化することがわかった.3.総括:本ペプチドが従来のベクターとは異なったメカニズムでAONの細胞内導入を可能にしたことは,アンチセンス療法の発展に寄与できる可能性があると考えられる.

这项研究的目的是开发基因治疗中的基因转移载体1。肽载体的设计和合成，对反义寡核苷酸（AON）通道形成的细胞内引入，膜的渗透率位点和基本接头位点的固定在静电上，并使用Fmoc固体层合成，并合成7种类型Synthesis.p-1：ac-u-n-i-i-u-u-u-l-l-l-l-l-u-p-k-k-k-k-k-oh; p-2：ac-u-u-n-u-ni-u-u-p-l-l-l-l-l-l-u-p-nh（ch_2）_2n（ch_3）_2; p-3; p-3; ac-u-u-u-u-u-u---u-u--u--u-u--u--u-u--u--u-u--u--u-u--u-u--u--u-u--u-u--u-u--u-p- u-u-u-u-u-u-u-u-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-- K-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-- K-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-- -k-k-k-k-k-k-oh; p-4：ac-u-u-u-u-u-u-u-u-u-u-u-u-u-u-u-p-k-k-k-k-k-k-k-k-k-v-oh; p-5：ac-u-u-u-u-u-u-u-u-u-u -g-nh（ch_2）_2n（ch_3）_2; p-6：ac-u-a-a-u-a-a-a-a-q-u-l-l-l-u-l-u-l-u-l-u-l-u-u-u-u-u-u-u-u-u-p-v-v-v-v-v-u-b-b-e-q-f-nh（ch_ 2)_2N(CH_3)_2;P-7:Ac-U-A-U-A-Q-U-L-U-G-U-P-V-U-B-E-Q-F-K-K-K-K-K-K-OH.Fluorescent labeled-AON/peptides were preincubated at various molar ratios to form complexes, and the AON/peptide complexes were formed by NIH3T3,A549在37°C孵育2小时后，通过流式细胞仪检查AON的诱导率。此外，在NIH3T3细胞中，通过测量乳酸脱氢酶（LDH）的泄漏进行了aon/pi = 1/10和1/15，Aon/p7 = 1/10和1/10之间的AON/PI之间观察到AON的膜通透性，并在细胞质量和成核中分布。然而，就诱导率而言，在脂质体载体脂肪系胺中观察到了AON的膜渗透性。此外，在抑制内吞作用的低温条件下观察到了这种现象。在这项研究中，其他肽没有观察到AON的膜渗透性。另一方面，在A549细胞中，没有观察到所有肽并非细胞毒性的细胞中的AON转移到所有肽中。2。使用CD光谱研究了使用物理化学技术对AON通透性机制分析的基本发现，对AON通透性机制的分析的基本发现，使用CD光谱研究了溶液和脂质体中P1和P7的构象分析。在溶液中，发现两种肽都是随机卷曲的，而在脂质体中，将两个肽变为螺旋结构3。摘要：该肽允许具有与常规载体不同的机制的细胞内引入AON这一事实可能有助于反义治疗的发展。

项目成果

和田俊一: "A Novel II-residual Peptaibol-Derived Carrier Peptide for in vitro Oligodeoxynucleotide Delivery into Cell"Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 14・10. 2563-2566 (2004)

Shunichi Wada：“用于体外寡脱氧核苷酸递送到细胞中的新型 II 残留 Peptaibol 衍生载体肽”生物有机与药物化学快报 14・10（2004 年）。