翻訳の不正確性制御による新規遺伝子治療法の開発

通过控制翻译不准确性开发新的基因治疗方法

• 批准号: 18J12857
• 负责人: 山下 隼
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-25 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18J12857/
• 关键词: アンチセンスオリゴヌクレオチド; リードスルー治療法; リボソーム; 翻訳終結

ナンセンス変異は、アミノ酸に対応するコドンが終止コドン（PTC）に置きかわる変異で、タンパク質合成が途中で終了し機能不全のタンパク質が合成されるため、重篤な疾患につながる。そのような疾患を治療する手法としてリードスルー療法が知られている。この手法では、リボソームがPTCを翻訳する際に誤ったアミノアシルtRNAを取り込ませることで、全長タンパク質を産生させる。これまで翻訳の正確性を低下させる化合物はリードスルー治療に利用されてきた。しかし、不正確な翻訳を非特異的に誘導することによる毒性が臨床応用を制限している。本研究では、標的の終止コドン特異的なリードスルーを可能にする新規リードスルー戦略の開発を行った。我々は、真核生物の翻訳終結機構に着目した。近年報告されたcryo-EM解析によって、真核生物終結因子（eRF）は終止コドンに結合すると、mRNAをU字型コンフォメーションに変形させることが示された。 U-ternの形成はmRNAをリボソーム内トンネルに引き込む。したがって我々は、PTC下流に結合するオリゴヌクレオチドが、mRNAの引き込み、すなわち翻訳終結を阻害し、アミノアシルtRNAの取り込みを誘導すると仮定した。PTCを導入した変異ルシフェラーゼをレポーターとして、オリゴヌクレオチドの結合部位や長さを最適化したところ、配列特異的なリードスルーを誘導することに成功した。また、ウエスタンブロッティングで全長タンパク質を検出することに成功した。また、本手法は真核生物由来の無細胞翻訳系でのみ適用できたことから、仮定に基づいた機序でリードスルーが誘導されていることが示唆される。PTC特異的にリードスルーを誘導できる本手法は、難治性遺伝病に対するリードスルー療法における問題を克服することが期待される。

废话突变是一个突变，其中与氨基酸相对应的密码子被密码子（PTC）的末端中断，并且蛋白质合成终止在中间，并且合成功能障碍的蛋白质，从而导致严重的疾病。铅 - 直通疗法被称为治疗此类疾病的一种方法。在这种方法中，核糖体在翻译PTC时通过掺入不正确的氨基酸tRNA来产生总长度蛋白。到目前为止，降低翻译准确性的化合物已用于直接治疗。但是，通过诱导不正确的翻译无限期限制临床应用来毒性。在这项研究中，我们制定了一种新的铅策略，该策略可以使目标密码子特异性铅的结束。我们专注于真核生物翻译的结局机制。近年来报道的冷冻EM分析表明，当真核生物最终因素（ERF）与终端密码子结合时，mRNA会转化为U形的混淆。 U-TERT是通过将mRNA吸入核糖体的隧道中形成的。因此，我们假设结合PTC下游的寡核苷酸抑制mRNA，即翻译的末端，并诱导氨inasiltRNA的包含。通过优化引入PTC的突变荧光素酶的寡核苷酸的结合位点和长度，成功诱导了阵列特异性的铅 - 直通。他还成功地通过蛋白质印迹检测了总长蛋白。另外，由于该方法只能应用于来自真核生物的无细胞翻译系统，因此建议通过基于假设的机制来指导铅 - 直通。 PTC - 特异性铅 - 预计将克服铅 - 直通遗传疾病的铅疗法问题。