アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた筋ジストロフィー遺伝子治療に関する研究

利用反义寡核苷酸进行肌营养不良症基因治疗的研究

基本信息

批准号：
08770560
负责人：
竹島泰弘
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

【背景】ジストロフィン遺伝子の欠失により、mRNA上での欠失している領域の塩基数が3の倍数+1あるいは+2(out-of-frame)であるとDuchenne型筋ジストロフィー症(DMD)となるが、3の倍数(in-frame)であるとより軽症なBecker型筋ジストロフィー症(BMD)となる。申請者は先にエクソン19内に存在するエクソン認識配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド(AS-oligo)によりエクソンをスキッピングさせることが可能であることをin vitroで明らかにしたが、このことを臨床に応用することができると、DMDの症例の欠失領域に隣接する1ないし数個のエクソンを、AS-oligoによりmRNA上から消失させ、欠失領域をin-frameに変え、表現型をDMDよりBMDに変更することが可能である。このような臨床応用を考える上での基礎研究として、試験管内でみられたAS-oligoによるエクソンスキッピングの誘導が培養細胞においても認められるか否かを検討した。【方法】ジストロフィン遺伝子エクソン19内に存在するエクソン認識配列に対するAS-oligoをリポフェクチン法によってヒトリンパ芽球様細胞に導入した。導入後経時的にジストロフィンmRNAを、RT-PCR法によって解析した。【結果と考案】AS-oligo導入6時間後よりエクソン19をスキップしたmRNAが認められるようになり、24時間後にはすべてのmRNAにおいてエクソン19のスキッピングが見られた。エクソン19以外のエクソンスキッピングは認められず、また他のエクソンに対するAS-oligoではエクソン19のスキッピングはみられなかった。培養細胞においてAS-oligoにより特異的にエクソンスキッピングを誘導することが可能であることが明らかとなった。このことは生体内においてこの機構を利用してDMDの遺伝子治療を行える可能性を示唆している。

[背景]由于缺失肌营养不良蛋白基因，mRNA上丢失区域的碱基数为3个或+2的倍数（框架外）和杜刺型肌肉肌营养不良（DMD）。如果3（框内）的数量是更轻微的肌肉营养不良（BMD）。申请人在体外表明，反义寡核苷酸（AS-OLIGO）可以跳过外显子19，而外显子19的外显子19，但如果可能的话，它适用于临床。 DMD病例是通过AS-Oligo从mRNA中删除的，丢失的区域被更改为框架，并且表达式类型为BMD，可以将其更改为BMD。作为考虑此类临床应用的基础研究，我们检查了在试管中发现的AS-Oligo的前击指导是否在培养细胞中识别出来。 [方法]通过脂爱肽方法将异常识别序列的As-Oligo引入了肌瘤蛋白基因19中的序列。引入后，通过RT-PCR方法分析了Zystrofin mRNA。 [结果和想法] MRNA在引入As-Oligo的六个小时后跳过Exonson，得到了认可，在24小时后，看到了所有mRNA跳过。除了Exonson 19以外，Exonson踢了其他踢，也没有其他外显子跳过的X-Oligo。据表明，AS-Oligo可以在培养的细胞中特别诱导As-Oligo诱导。这表明可以在活体中使用DMD来提供DMD基因处理的可能性。