Expanding the genetic code with phosphotyrosine and phosphothreonine

用磷酸酪氨酸和磷酸苏氨酸扩展遗传密码

• 批准号: 10062991
• 负责人: Farren J. Isaacs
• 金额: $ 31.01万
• 依托单位: YALE UNIVERSITY
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2017-12-02 至 2022-11-30
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/10062991
• 关键词: Address; Amino Acids; Amino Acyl-tRNA Synthetases; Biological; Cells; Charge; Chemicals; Chemistry; Clinical; Codon Nucleotides; Complex; Data; Diabetes Mellitus; Disease; Elongation Factor; Engineering; Escherichia coli; Evolution; Exhibits; Genetic Code; Genome engineering; Goals; Homeostasis; Human; Hypertension; Laboratories; Libraries; Location; Malignant Neoplasms; Mass Spectrum Analysis; Metabolic; Methods; Modification; Molecular Evolution; Mutagenesis; Neurodegenerative Disorders; Outcome; Pattern; Phosphoamino Acids; Phosphopeptides; Phosphoproteins; Phosphorylation; Phosphoserine; Phosphothreonine; Phosphotyrosine; Physiological; Polymers; Population; Positioning Attribute; Post-Translational Protein Processing; Protein Biosynthesis; Protein Kinase; Proteins; Recombinant Proteins; Recombinants; Research; Sense Codon; Serine; Set protein; Signal Transduction; Signaling Protein; Site; Surface; Synthesis Chemistry; System; Techniques; Technology; Terminator Codon; Threonine; Transfer RNA; Translations; Tyrosine; Variant; Work; base; design; experimental study; flexibility; human disease; innovation; interest; mutant; new technology; novel; novel therapeutics; programs; prototype; tool

Project Summary  This proposed work seeks to develop a suite of enabling technologies capable of producing synthetic  phosphoproteins with the goal of transforming the field of human protein signaling from one that is purely  observation‐based into one that biosynthesizes designer proteins to achieve a comprehensive understanding of  complex signaling networks. The importance of phosphorylation is emphasized by the fact that  phosphorylated proteins control most aspects of normal cellular homeostasis.  Aberrations in protein  phosphorylation can drive cancer, hypertension, diabetes, and neurodegenerative disorders.  Thus,  understanding differential patterns of protein phosphorylation in disease states is of extreme physiological  and clinical interest.  Analysis of phosphorylated amino acid residues has been limited by our inability to  control these chemical modifications due to a lack of phosphomimetics that fully recapitulate the chemistry of  phosphorylated residues. Current progress toward the elucidation of phospho‐signaling networks is  hampered by the lack of methods to produce proteins containing specific combinations of phosphorylated  amino acids. In particular, synthetic chemistry is inadequate for total phosphoprotein synthesis, and  conventional biological methods do not control phosphorylation levels. We have recently developed a new  technology, albeit limited to phosphoserine (pSer), that enables the synthesis of recombinant phosphoproteins.   This technology directs phosphorylated amino acids into their physiologically relevant positions within  proteins yet our functional understanding of protein phosphorylation will remain incomplete without access  to phosphotyrosine (pTyr) and phosphothreonine (pThr) containing proteins. Specific Aims: In Aim 1, we will  utilize mutagenesis and laboratory evolution to engineer an optimized tyrosyl aminoacyl‐tRNA synthetase for  phosphotyrosine.  In Aim 2, we will provide a solution to this problem by engineering an aminoacyl‐tRNA  synthetase that can charge a phosphothreonine onto a special tRNA that reads a dedicated open codon.  Unique to our approach, we will also employ our genomically recoded E. coli cells in which open stop codons  can be converted into new sense codons that encode pThr and pTyr into precise locations in recombinant  proteins. Significance: The overall outcome of our studies will be an enabling technology for the expression of  pTyr and pThr containing proteins that will broadly enable research into disease mechanisms and can be used  directly to develop new therapies for human disease. This will be the first technology able to re‐create human  disease networks that are “difficult” or “impossible” to infiltrate, and will establish the paradigm for  addressing other post‐translational modifications. More broadly, the proposed work will enable the re‐design  of programmable signaling networks comprising proteins with natural and synthetic nonstandard amino acids  capable of expanding networks beyond their natural functions and of producing novel synthetic polymers  with diverse chemistries.

项目摘要 这项拟议的工作旨在开发一套能够生产合成的技术 磷蛋白的目的是将人类蛋白质信号的领域转化为纯粹的磷酸蛋白 基于观察到生物合成的设计器蛋白质，以实现对 复杂的信号网络。通过以下事实强调了磷酸化的重要性 磷酸化的蛋白质控制正常细胞稳态的大多数方面。蛋白质的像差 磷酸化可以促进癌症，高血压，糖尿病和神经退行性疾病。那， 了解疾病状态中蛋白质磷酸化的差异模式是极端的生理 和临床兴趣。磷酸化氨基酸残基的分析受到我们无法 由于缺乏完全概括的化学性能，控制这些化学修饰 磷酸化残基。阐明磷酸化信号网络的当前进展是 由于缺乏产生蛋白质含有特定磷酸化的特定组合的蛋白质的方法阻碍 氨基酸。特别是，总磷蛋白合成不足，而合成化学不足 常规的生物学方法不控制磷酸化水平。我们最近开发了一个新的 技术，尽管仅限于磷酸（PSER），但可以合成重组磷蛋白。 该技术将磷酸化的氨基酸引导到内部的物理相关位置 蛋白质然而，我们对蛋白质磷酸化的功能理解将不完整，而无需进入 到含有蛋白质的磷酸酪氨酸（PTYR）和磷酸（PTHR）。具体目的：在AIM 1中，我们将 利用诱变和实验室进化来设计优化的酪酰氨基酰基-TRNA合成酶 磷酸酪氨酸。在AIM 2中，我们将通过设计氨基酰基-TRNA来解决此问题的解决方案 可以在读取专用开放密码子的特殊tRNA上充电磷酸的合成酶。 在我们的方法中，我们还将采用我们的基因组化大肠杆菌细胞，其中开放式终止密码子 可以转换为新的感官密码子，将PTHR和PTYR编码为重组中的精确位置 蛋白质。意义：我们研究的总体结果将是一种表达的能力 PTYR和PTHR含有蛋白质，可以广泛地研究疾​​病机制，可以使用 直接开发针对人类疾病的新疗法。这将是第一个可以重新创建人类的技术 “困难”或“不可能”渗透的疾病网络，并将建立范式 解决其他翻译后修改。更广泛地，拟议的工作将使重新设计 可编程信号网络用天然和合成的非标准氨基酸编译蛋白质 能够扩展超出自然功能的网络并产生新型的合成聚合物 具有多样化的化学作用。

项目成果

Enhanced access to the human phosphoproteome with genetically encoded phosphothreonine.

• DOI: 10.1038/s41467-022-34980-5
• 发表时间: 2022-11-24
• 期刊: NATURE COMMUNICATIONS
• 影响因子: 16.6
• 作者: Moen, Jack M.;Mohler, Kyle;Rogulina, Svetlana;Shi, Xiaojian;Shen, Hongying;Rinehart, Jesse
• 通讯作者: Rinehart, Jesse

Mapping the in vivo fitness landscape of a tethered ribosome.

• DOI: 10.1126/sciadv.ade8934
• 发表时间: 2023-04-28
• 期刊: SCIENCE ADVANCES
• 影响因子: 13.6
• 作者: Radford, Felix;Rinehart, Jesse;Isaacs, Farren J.
• 通讯作者: Isaacs, Farren J.

The ABCs of PTMs.

• DOI: 10.1038/nchembio.2572
• 发表时间: 2018-02-14
• 期刊: Nature chemical biology
• 影响因子: 14.8
• 作者: Barber KW;Rinehart J
• 通讯作者: Rinehart J

Next-generation genetic code expansion.

• DOI: 10.1016/j.cbpa.2018.07.020
• 发表时间: 2018-10
• 期刊: Current opinion in chemical biology
• 影响因子: 7.8
• 作者: Arranz-Gibert P;Vanderschuren K;Isaacs FJ
• 通讯作者: Isaacs FJ

Chemoselective restoration of para-azido-phenylalanine at multiple sites in proteins.

• DOI: 10.1016/j.chembiol.2021.12.002
• 发表时间: 2022-06-16
• 期刊: CELL CHEMICAL BIOLOGY
• 影响因子: 8.6
• 作者: Arranz-Gibert, Pol;Vanderschuren, Koen;Haimovich, Adrian;Halder, Anushka;Gupta, Kallol;Rinehart, Jesse;Isaacs, Farren J.
• 通讯作者: Isaacs, Farren J.