Expanding the genetic code with phosphotyrosine and phosphothreonine

用磷酸酪氨酸和磷酸苏氨酸扩展遗传密码

• 批准号: 10062991
• 负责人: Farren J. Isaacs
• 金额: $ 31.01万
• 依托单位: YALE UNIVERSITY
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2017-12-02 至 2022-11-30
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/10062991
• 关键词: Address; Amino Acids; Amino Acyl-tRNA Synthetases; Biological; Cells; Charge; Chemicals; Chemistry; Clinical; Codon Nucleotides; Complex; Data; Diabetes Mellitus; Disease; Elongation Factor; Engineering; Escherichia coli; Evolution; Exhibits; Genetic Code; Genome engineering; Goals; Homeostasis; Human; Hypertension; Laboratories; Libraries; Location; Malignant Neoplasms; Mass Spectrum Analysis; Metabolic; Methods; Modification; Molecular Evolution; Mutagenesis; Neurodegenerative Disorders; Outcome; Pattern; Phosphoamino Acids; Phosphopeptides; Phosphoproteins; Phosphorylation; Phosphoserine; Phosphothreonine; Phosphotyrosine; Physiological; Polymers; Population; Positioning Attribute; Post-Translational Protein Processing; Protein Biosynthesis; Protein Kinase; Proteins; Recombinant Proteins; Recombinants; Research; Sense Codon; Serine; Set protein; Signal Transduction; Signaling Protein; Site; Surface; Synthesis Chemistry; System; Techniques; Technology; Terminator Codon; Threonine; Transfer RNA; Translations; Tyrosine; Variant; Work; base; design; experimental study; flexibility; human disease; innovation; interest; mutant; new technology; novel; novel therapeutics; programs; prototype; tool

Project Summary  This proposed work seeks to develop a suite of enabling technologies capable of producing synthetic  phosphoproteins with the goal of transforming the field of human protein signaling from one that is purely  observation‐based into one that biosynthesizes designer proteins to achieve a comprehensive understanding of  complex signaling networks. The importance of phosphorylation is emphasized by the fact that  phosphorylated proteins control most aspects of normal cellular homeostasis.  Aberrations in protein  phosphorylation can drive cancer, hypertension, diabetes, and neurodegenerative disorders.  Thus,  understanding differential patterns of protein phosphorylation in disease states is of extreme physiological  and clinical interest.  Analysis of phosphorylated amino acid residues has been limited by our inability to  control these chemical modifications due to a lack of phosphomimetics that fully recapitulate the chemistry of  phosphorylated residues. Current progress toward the elucidation of phospho‐signaling networks is  hampered by the lack of methods to produce proteins containing specific combinations of phosphorylated  amino acids. In particular, synthetic chemistry is inadequate for total phosphoprotein synthesis, and  conventional biological methods do not control phosphorylation levels. We have recently developed a new  technology, albeit limited to phosphoserine (pSer), that enables the synthesis of recombinant phosphoproteins.   This technology directs phosphorylated amino acids into their physiologically relevant positions within  proteins yet our functional understanding of protein phosphorylation will remain incomplete without access  to phosphotyrosine (pTyr) and phosphothreonine (pThr) containing proteins. Specific Aims: In Aim 1, we will  utilize mutagenesis and laboratory evolution to engineer an optimized tyrosyl aminoacyl‐tRNA synthetase for  phosphotyrosine.  In Aim 2, we will provide a solution to this problem by engineering an aminoacyl‐tRNA  synthetase that can charge a phosphothreonine onto a special tRNA that reads a dedicated open codon.  Unique to our approach, we will also employ our genomically recoded E. coli cells in which open stop codons  can be converted into new sense codons that encode pThr and pTyr into precise locations in recombinant  proteins. Significance: The overall outcome of our studies will be an enabling technology for the expression of  pTyr and pThr containing proteins that will broadly enable research into disease mechanisms and can be used  directly to develop new therapies for human disease. This will be the first technology able to re‐create human  disease networks that are “difficult” or “impossible” to infiltrate, and will establish the paradigm for  addressing other post‐translational modifications. More broadly, the proposed work will enable the re‐design  of programmable signaling networks comprising proteins with natural and synthetic nonstandard amino acids  capable of expanding networks beyond their natural functions and of producing novel synthetic polymers  with diverse chemistries.

项目概要 这项拟议的工作旨在开发一套能够生产合成材料的技术。 磷蛋白的目标是将人类蛋白质信号传导领域从纯粹的磷蛋白转变为磷蛋白 基于观察的生物合成设计蛋白质以实现对 复杂的信号网络的重要性通过以下事实得到强调。 磷酸化蛋白质控制正常细胞稳态的大部分方面。 磷酸化可导致癌症、高血压、糖尿病和神经退行性疾病。 了解疾病状态下蛋白质磷酸化的差异模式具有极端的生理学意义 磷酸化氨基酸残基的分析因我们无法进行而受到限制。 由于缺乏完全概括化学性质的磷模拟物而控制这些化学修饰 磷酸化残基的当前进展是阐明磷酸信号网络。 由于缺乏生产含有磷酸化特定组合的蛋白质的方法而受到阻碍 特别是，合成化学不足以合成总磷蛋白，并且 传统的生物方法无法控制磷酸化水平，我们最近开发了一种新的方法。 尽管仅限于磷酸丝氨酸（pSer），但该技术能够合成重组磷蛋白。 该技术将磷酸化氨基酸引导至其生理相关位置 如果不访问蛋白质，我们对蛋白质磷酸化的功能性理解将仍然不完整 含有蛋白质的磷酸酪氨酸 (pTyr) 和磷酸苏氨酸 (pThr)。 具体目标：在目标 1 中，我们会。 利用诱变和实验室进化来设计优化的酪氨酰-tRNA 合成酶 在目标 2 中，我们将通过设计氨酰基-tRNA 来解决这个问题。 合成酶可以将磷酸苏氨酸装载到读取专用开放密码子的特殊 tRNA 上。 我们的方法独特的是，我们还将使用基因组重新编码的大肠杆菌细胞，其中开放终止密码子 可以转化为新的有义密码子，将 pThr 和 pTyr 编码到重组体中的精确位置 意义：我们研究的总体结果将是一种表达蛋白质的技术。 pTyr 和 pThr 含有蛋白质，可广泛用于疾病机制研究并可用于 直接开发人类疾病的新疗法这将是第一个能够重新创造人类的技术。 “难以”或“不可能”渗透的疾病网络，并将建立一个范式 更广泛地说，拟议的工作将使重新设计成为可能。 由具有天然和合成非标准氨基酸的蛋白质组成的可编程信号网络。 能够将网络扩展到超出其自然功能并生产新型合成聚合物 具有不同的化学性质。

项目成果

Enhanced access to the human phosphoproteome with genetically encoded phosphothreonine.

• DOI: 10.1038/s41467-022-34980-5
• 发表时间: 2022-11-24
• 期刊: NATURE COMMUNICATIONS
• 影响因子: 16.6
• 作者: Moen, Jack M.;Mohler, Kyle;Rogulina, Svetlana;Shi, Xiaojian;Shen, Hongying;Rinehart, Jesse
• 通讯作者: Rinehart, Jesse

Mapping the in vivo fitness landscape of a tethered ribosome.

• DOI: 10.1126/sciadv.ade8934
• 发表时间: 2023-04-28
• 期刊: SCIENCE ADVANCES
• 影响因子: 13.6
• 作者: Radford, Felix;Rinehart, Jesse;Isaacs, Farren J.
• 通讯作者: Isaacs, Farren J.

The ABCs of PTMs.

• DOI: 10.1038/nchembio.2572
• 发表时间: 2018-02-14
• 期刊: Nature chemical biology
• 影响因子: 14.8
• 作者: Barber KW;Rinehart J
• 通讯作者: Rinehart J

Next-generation genetic code expansion.

• DOI: 10.1016/j.cbpa.2018.07.020
• 发表时间: 2018-10
• 期刊: Current opinion in chemical biology
• 影响因子: 7.8
• 作者: Arranz-Gibert P;Vanderschuren K;Isaacs FJ
• 通讯作者: Isaacs FJ

Chemoselective restoration of para-azido-phenylalanine at multiple sites in proteins.

• DOI: 10.1016/j.chembiol.2021.12.002
• 发表时间: 2022-06-16
• 期刊: CELL CHEMICAL BIOLOGY
• 影响因子: 8.6
• 作者: Arranz-Gibert, Pol;Vanderschuren, Koen;Haimovich, Adrian;Halder, Anushka;Gupta, Kallol;Rinehart, Jesse;Isaacs, Farren J.
• 通讯作者: Isaacs, Farren J.