GFP融合蛋白を用いた分泌顆粒形成機構および放出機構の解析

使用 GFP 融合蛋白分析分泌颗粒形成和释放机制

基本信息

批准号：
08770014
负责人：
渡部剛
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

クロモグラニン・セクレトグラニン蛋白群(グラニン蛋白群)は、その生理的機能に関してはいまだ不明の点が多いが、内分泌細胞の分泌顆粒内に局在するという共通の性質を有している。本研究ではこの性質に着目して、特別なcofactorなしに緑色螢光を発する発光クラゲの細胞質中の蛋白、GFP(Green Fluorescent Protein、238アミノ酸残基)とグラニン蛋白との融合蛋白のcDNAを構築し、蛋白分泌性の内分泌組織由来の培養細胞株に導入して、「光る分泌顆粒」を持つ細胞の作製を試みた。まず、この蛋白群に属する主要な3種類の蛋白、クロモグラニンA(CgA)、クロモグラニンB(CgB)、およびセクレトグラニンII(SgII)のカルボキシル末端にそれぞれGFPを融合させた蛋白のcDNAを構築し、ラット褐色細胞腫由来の培養細胞株PC12細胞に遺伝子導入法によって発現させた。融合蛋白の発現の程度はNorthern Blot法で確認し、内因性のグラニン蛋白に匹敵する発現量をもつクローンを単離することができた。この樹立された細胞クローンにおける融合蛋白の細胞内局在を抗GFP抗体による免疫染色で調べたところ、GFPをどのグラニン蛋白に融合させた場合でも、融合蛋白は内因性のグラニン蛋白と同様に分泌顆粒に局在していた。また免疫沈降法によって、融合蛋白が分泌刺激に応答して培地中に放出されることも確認された。ところが、生きたままのPC12細胞でGFPの発光が観察できないかどうか、螢光顕微鏡及びレーザー共焦点顕微鏡を用いて検討しているが、今までのところ成功していない。この原因として、分泌顆粒内のpHやカルシウム濃度などの微小環境が今回使用したGFPの発光に適切でない可能性が考えられたため、融合蛋白中のGFPを発光強度が高い改変型GFPに置換して、現在さらに検討を続けている。なお、以上の研究成果の一部は、第102回解剖学会総会(1997年3月、愛知)で報告した。

嗜铬粒蛋白/分泌粒蛋白组（颗粒蛋白组）具有定位于内分泌细胞的分泌颗粒内的共同特性，尽管其生理功能仍存在许多未知数。在本研究中，我们针对这一特性，构建了 GFP（绿色荧光蛋白，238 个氨基酸残基）与颗粒蛋白之间的融合蛋白 cDNA，GFP 是发光水母细胞质中的一种蛋白，不需要特殊的辅因子即可发出绿色荧光。然后他们将其引入源自蛋白质分泌内分泌组织的培养细胞系中，试图创造具有“发光的分泌颗粒”的细胞。首先，我们构建了蛋白质的 cDNA，其中 GFP 融合到属于该蛋白质组的三种主要蛋白质（嗜铬粒蛋白 A (CgA)、嗜铬粒蛋白 B (CgB) 和分泌粒蛋白 II (SgII)）中的每一个的羧基末端。通过基因转移方法在大鼠嗜铬细胞瘤来源的培养细胞系PC12细胞中表达。通过Northern Blot方法确认融合蛋白的表达程度，并分离出表达水平与内源颗粒蛋白相当的克隆。通过抗-GFP抗体的免疫染色研究了该建立的细胞克隆中融合蛋白的细胞内定位，发现无论哪一种颗粒蛋白与GFP融合，该融合蛋白都以与内源颗粒蛋白相同的方式分泌。它位于颗粒中。免疫沉淀也证实融合蛋白响应分泌刺激而释放到培养基中。然而，我们正在研究是否有可能使用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察活体PC12细胞中的GFP发射，但到目前为止我们还没有成功。其原因被认为是分泌颗粒内的微环境，如pH和钙浓度，不适合本研究中使用的GFP发光，因此我们将融合蛋白中的GFP替换为修饰后的GFP。具有更高发光强度的 GFP 版本目前正在进行进一步研究。上述部分研究成果已在第102届解剖学会会员大会（1997年3月，爱知县）上报告。