遺伝子導入法を用いたクロモグラニン・セクレトグラニン蛋白群の機能解析

使用基因转移方法对嗜铬粒蛋白和分泌粒蛋白进行功能分析

基本信息

批准号：
07770003
负责人：
渡部剛
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

申請者はこれまでに、内分泌細胞におけるクロモグラニン・セクレトグラニン蛋白群の局在に注目し、同蛋白群の生理的役割について検討してきた。この蛋白群に属する主要なものとしてクロモグラニンA(CgA)、クロモグラニンB(CgB)、およびセクレトグラニンII(SgII)の3種があり、いずれも様々な内分泌細胞の分泌顆粒内に蓄積され、分泌刺激に応答してホルモンとともに血中に放出される。しかしながら、これらの蛋白がどのようなメカニズムによって分泌顆粒に蓄積され、分泌刺激が到来するまで細胞内に保持されるのかについては、解明されていなかった。そこで今回の研究課題では、グラニン蛋白群のどの部分が分泌顆粒へのソーティングシグナルとなっているか、Epitope-tagging法を用いて検討した。まず、グラニン蛋白群のcDNAにc-myc由来の既知エピトープを付加した後、ラット褐色細胞腫由来の培養細胞株PC12に導入した。その結果、グラニン蛋白群(CgA,CgB,SgII)にアミノ酸10残基からなるc-myc由来エピトープを付加しても、その分泌顆粒への局在性に関しては影響を受けず、内因性のグラニン蛋白と同様に分泌顆粒に輸送されることが確かめられた。次に、このグラニン蛋白群分子のどの部分が分泌顆粒への局在に関与しているか、グラニン蛋白群のうちCgAに注目して様々な長さのCgAのdeletion mutantsを作製し、そのPC12細胞内での局在性について検討した。その結果、CgA全長448アミノ酸残基のうち、カルボキシル末端側408残基を欠失させたアミノ末端側40残基のみからなる部分のみでも正しく分泌顆粒に輸送されることから明らかになった。さらに、このCgAアミノ末端側の40残基からなる部分に、本来細胞質に局在する蛋白であるGreen Fluorescent Protein(GFP、238アミノ酸残基)を融合し、この融合蛋白がPC12細胞内でどこに局在するか検討した。その結果、この融合蛋白は分泌顆粒内に局在するのが観察された。以上の結果をまとめると、(1)CgA分子が分泌顆粒に蓄積されるためには、アミノ末端側の40残基からなる部分が必要であり、(2)本来細胞質に局在する蛋白であっても、このCgA分子アミノ末端側の40残基からなる部分が付加されれば、分泌顆粒内に局在が変更されるということが明らかにされた。これらの所見から、CgA分子アミノ末端側の40残基からなる部分は分泌顆粒への局在シグナルとして機能している可能性が強く示唆された。以上の研究成果の一部は、第101回解剖学会総会(1996年4月、福岡)で報告した。

迄今为止，申请人专注于嗜铬粒蛋白和分泌粒蛋白在内分泌细胞中的定位，并研究了这些蛋白的生理作用。属于该蛋白组的主要蛋白有3种：嗜铬粒蛋白A（CgA）、嗜铬粒蛋白B（CgB）和分泌粒蛋白II（SgII），它们都积聚在各种内分泌细胞的分泌颗粒中并分泌到血液中。以及对刺激做出反应的激素。然而，这些蛋白质在分泌颗粒中积累并保留在细胞内直至分泌刺激到来的机制尚未阐明。因此，在本研究项目中，我们利用表位标记方法来研究颗粒蛋白组的哪一部分作为分泌颗粒的分选信号。首先，将源自c-myc的已知表位添加到粒蛋白蛋白组的cDNA中，然后导入源自大鼠嗜铬细胞瘤的培养细胞系PC12中。结果，即使将由10个氨基酸残基组成的c-myc衍生表位添加到粒蛋白蛋白组(CgA、CgB、SgII)中，其向分泌颗粒的定位也不会受到影响，并且内源性粒蛋白被证实：它以与蛋白质相同的方式被转运至分泌颗粒。接下来，为了研究颗粒蛋白组分子的哪一部分参与分泌颗粒的定位，我们关注颗粒蛋白组中的CgA，创建了不同长度的CgA缺失突变体，并在PC12细胞中创建了CgA缺失突变体。检查了该区域内的定位。结果表明，在CgA的全长448个氨基酸残基中，只有仅由氨基末端40个残基组成、其中羧基末端408个残基被删除的部分正确地转运至分泌颗粒。此外，我们将最初位于细胞质中的绿色荧光蛋白（GFP，238个氨基酸残基）融合到CgA氨基末端侧的40个残基上，我们考虑了它是否存在。结果，观察到该融合蛋白位于分泌颗粒内。总结上述结果，(1)为了使CgA分子在分泌颗粒中积累，需要由40个氨基末端残基组成的部分，以及(2)该蛋白质最初位于细胞质中。将该 40 个残基部分添加到 CgA 分子的氨基末端侧改变了其在分泌颗粒内的定位。这些发现强烈表明，CgA 分子的氨基末端 40 个残基部分可能充当分泌颗粒的定位信号。上述部分研究成果已在第101届解剖学会会员大会（1996年4月，福冈）上报告。