Establishing CRISPR cell screening for the deer tick Ixodes scapularis, a vector of Lyme and other diseases

建立针对鹿蜱肩突硬蜱(莱姆病和其他疾病的载体)的 CRISPR 细胞筛选

基本信息

  • 批准号:
    10428801
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 26.38万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    美国
  • 项目类别:
  • 财政年份:
    2022
  • 资助国家:
    美国
  • 起止时间:
    2022-08-18 至 2024-07-31
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

Project Summary/Abstract Prevention of tick-borne illnesses would be significantly aided by the availability of new strategies for uncovering the functions of tick genes. Ixodes scapularis is an arthropod vector of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi and other emerging human pathogens, including the rickettsial agent Anaplasma phagocytophilum, the flavivirus Powassan, and the parasite Babesia microti. Unfortunately, genetic studies of ticks are significantly hindered by practical barriers, including the approximately two-year life cycle of I. scapularis. An alternative approach is to perform CRISPR screening in cultured cells, which in other systems is an established robust and large-scale approach to uncovering new information about cellular activities and pathways. We have successfully developed a method for genome-wide CRISPR screening in insect cells that is extensible to ticks. In this R21 application, we will establish a genome-wide pooled CRISPR cell screening platform for I. scapularis cultured cells as a scientific resource for the community. Tick cell culture has been extensively used to investigate microbial interactions and can be used to predict the complex physiology of I. scapularis without the challenges associated with the long-life cycle of ticks. Specifically, we will use our combined knowledge of I. scapularis cultured cells and CRISPR cell screening to: (i) design single guide RNAs (sgRNAs) for CRISPR modification based on the reference genome sequence and other genome sequences of this species; (ii) identify appropriate U6 promoters for sgRNA expression in I. scapularis cells; (iii) modify cells for screening, such as by making the competent for recombination mediated cassette exchange (RMCE) and by introducing Cas9; and (iv) test and optimize the efficiency of CRISPR-based knockout strategies in these cells. Concurrent with this work, we will develop cell-based assays appropriate for pooled-format screens that interrogate tick immune signaling via the immune defense (IMD) and JAK/STAT pathways. Notably, the type of large-scale and unbiased approach we propose will provide an important complement to reverse genetic in vivo analyses. Establishment of CRISPR screening in I. scapularis cells will propel the field of tick biology forward at a rapid pace, provide novel insights into relationships between arthropod vectors and the microbes they host, foster collaborations between investigators with distinct expertise, and offer new opportunities for mentoring the next generation of scientists.
项目概要/摘要 采取新的策略将大大有助于预防蜱传疾病 揭示蜱基因的功能。肩胛硬蜱是莱姆病螺旋体的节肢动物媒介 伯氏疏螺旋体和其他新出现的人类病原体,包括立克次体无形体 噬细胞菌、黄病毒 Powassan 和寄生虫巴贝虫。不幸的是,基因研究 蜱虫受到实际障碍的严重阻碍,包括蜱虫大约两年的生命周期。 肩胛肌。另一种方法是在培养细胞中进行 CRISPR 筛选,这在其他系统中是 一种既定的稳健且大规模的方法,用于发现有关细胞活动的新信息和 途径。我们已经成功开发了一种在昆虫细胞中进行全基因组 CRISPR 筛选的方法, 可扩展到蜱虫。在此 R21 应用中,我们将建立全基因组汇集 CRISPR 细胞筛选 肩胛冈培养细胞的平台作为社区的科学资源。蜱细胞培养 广泛用于研究微生物相互作用,并可用于预测 I 的复杂生理学。 肩胛肌没有与蜱的长生命周期相关的挑战。具体来说,我们将使用我们的 结合肩胛肌培养细胞和 CRISPR 细胞筛选的知识,以:(i) 设计单引导 RNA (sgRNA),用于基于参考基因组序列和其他基因组序列进行 CRISPR 修饰 该物种的; (ii) 鉴定适合肩胛冈细胞中 sgRNA 表达的 U6 启动子; (三) 修改 用于筛选的细胞,例如通过使细胞具有重组介导的盒交换(RMCE)能力 并通过引入Cas9; (iv) 测试和优化基于 CRISPR 的基因敲除策略的效率 这些细胞。与这项工作同时,我们将开发适合混合格式筛选的基于细胞的测定法 通过免疫防御 (IMD) 和 JAK/STAT 途径询问蜱免疫信号。值得注意的是, 我们提出的大规模和公正的方法类型将为逆向提供重要的补充 体内遗传分析。在肩胛冈细胞中建立 CRISPR 筛选将推动蜱领域的发展 生物学的快速发展,为节肢动物载体和节肢动物之间的关系提供了新的见解 他们寄生的微生物,促进具有独特专业知识的研究人员之间的合作,并提供新的 指导下一代科学家的机会。

项目成果

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共享资源06:DNA资源
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    1997
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