細胞外環境での小さな操作分子イメージングツールの開発

细胞外环境中小型操纵分子成像工具的开发

基本信息

批准号：
13J11181
负责人：
鈴木貴久
金额：
$ 1.73万
依托单位：
Fukushima Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-26 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

最終年度として、これまで作成したプローブ全体について、評価をとりまとめ、応用への可能性について検討した。本課題が最重要課題とした、細胞外環境イメージング、さらに分子間相互作用解析が、この課題内で作成した一連の蛍光プローブを用いてはじめて可能となったことが、細胞外マトリクスタンパクにおいて証明できた。分子間相互作用では光変換型蛍光タンパク改変体を用いて、その変換特性を利用したFLIM-FRETが有効である事を示した。さらにまた、小胞体内腔での分子ダイナミクスを厳密に測定する場合に、特にこの改良した光変換型蛍光プローブが有用性を持つことも示した。これらを用いる事により、小胞体構造の変化の見かけの分子拡散に与える影響について知る事ができた。蛍光タグの大きさの問題に着目したプロジェクトにおいては、phototropin由来フラビン結合タンパクから改変された分子においてもっともよくその有用性が示され、これまでライブイメージングで再現されてなかった分泌タンパクの変異の異常性が、この改変体において唯一、再現されることを示した。さらに、このタグの最大の課題であった輝度について、飽和変異を重ねることにより、最終的に、既報のプローブの2倍程度に改善することができた。これは分子イメージングとして実用に足りる明るさである。最終的に、本研究目的において開発した蛍光タグは10種類を超える。これらは、細胞がどのようにして酸化的環境における生存戦略を進めてきたかを理解する新たなツールとなると期待される。

在最后一年，我们对迄今为止创建的整个探针进行了评估，并检查了应用程序的可能性。它在细胞外基质邮票中得到了证明，细胞外环境成像和分子间相互作用分析（最重要的问题）只有使用此任务中创建的一系列荧光探针才有可能。在分子间相互作用中，使用光转化荧光蛋白变体使用转化性质的FLIM-FRET有效。还已经表明，在测量内质网中分子动力学时，这种改善的光转化荧光探针特别有用。通过使用这些，我们能够了解内质网结构变化对明显分子扩散的影响。在关注荧光标签大小问题的项目中，其有用性在分子中证明了已从光蛋白衍生的黄蛋白结合蛋白所修饰的分子中，表明唯一在这种变体中重现的是唯一的成像，这是唯一的一个被活化的成像。此外，通过对亮度重叠的饱和突变，这是该标签的最大挑战，我们最终能够将亮度提高到先前报道的探针的两倍。这是一种用于分子成像的亮度。最后，为此目的开发了超过10个荧光标签。预计这些将是了解细胞在氧化环境中如何具有先进生存策略的新工具。