蛍光アセチルコリンセンサーによる細胞内コリン伝達系の実証

使用荧光乙酰胆碱传感器演示细胞内胆碱传输系统

基本信息

批准号：
22K06637
负责人：
宇和田淳介
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Kanazawa Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

ムスカリン受容体を含むGタンパク質共役型受容体は、通常細胞の表面に局在し、細胞外からのリガンドを受容して活性化を受ける。我々はアセチルコリンをリガンドとするムスカリンM1受容体が細胞の内部にも局在し、活性化されうることを明らかにしている。この研究では、細胞の内部でムスカリンＭ１受容体が活性化される様子を直接的に検出する系を確立し、そのメカニズムの全容に迫る目的で行われた。細胞内で活性化される様子を検出するためにＭ１受容体に循環置換GFPを導入し、活性化に伴う蛍光の増加を呈するセンサーとした。今年度は、試験的に得られていたセンサーを改良し、細胞内局在性と活性化に伴う応答の安定した新しいセンサーを開発した。改良の際には、循環置換GFPの導入位置によって、蛍光変化量と細胞内局在性が大きく影響を受けることが分かり、結果的に多くの試作を行う必要が生じた。最終的に得られた同センサーを用いることで、細胞内Ｍ１受容体の活性化が、リガンドの細胞膜透過性の有無により影響を受けることを確認した。つまり、脂溶性が高く細胞膜を容易に透過するアゴニストは細胞内Ｍ１受容体を活性化し、水溶性が高く細胞膜透過性の低いアゴニストは細胞表面のＭ１受容体のみを活性化する。更に細胞膜透過性のない内因性リガンドであるアセチルコリンが、特定のトランスポーターによって細胞内へ輸送され、細胞内Ｍ１受容体を活性化する様子を確認した。更に、この活性化を可能とするトランスポーターについては、ヒトとマウスで一部異なる結果を得ており、現在その原因について解析を進めている。

G蛋白偶联受体（包括毒蕈碱受体）通常位于细胞表面，并通过接收细胞外配体激活。我们已经表明，基于乙酰胆碱的毒蕈碱M1受体也可以在细胞中定位和激活。进行这项研究的目的是建立一个直接检测细胞内毒蕈碱M1受体激活并仔细研究机制的系统。为了检测细胞的激活，将循环GFP引入了M1受体，并随着激活而表现出荧光的增加。今年，我们改善了经过测试和开发的传感器，该传感器在亚细胞定位和对激活的响应方面稳定。在改进过程中，发现荧光变化和亚细胞定位受到循环取代GFP的引入位置的极大影响，因此，有必要执行许多原型。使用最终获得的传感器，证实细胞内M1受体的激活受配体的细胞膜渗透性的存在或不存在。换句话说，高脂肪溶剂并容易透化细胞膜的激动剂会激活细胞内M1受体，而高度水溶性且仅透化细胞表面仅激活M1受体的激动剂。此外，已经证实，乙酰胆碱是一种不可渗透细胞膜的内源性配体，由特定转运蛋白转运到细胞中，并激活细胞内M1受体。此外，人类和小鼠在使这种激活的转运蛋白方面已经获得了一些差异，目前正在分析原因。