タンパク質複合体の動きをリアルタイムで追跡するGFPトラッキング法の確立

建立实时追踪蛋白质复合物运动的GFP追踪方法

基本信息

批准号：
22K19268
负责人：
荒磯裕平
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19268/
关键词：
タンパク質複合体高速原子間力顕微鏡 GFP

项目摘要

本研究課題では、クライオ電子顕微鏡解析で得られた精密構造情報と高速原子間力顕微鏡（HS-AFM）解析で得られる動的構造情報を組み合わせて、タンパク質複合体のサブユニットレベルでのダイナミクスを容易に解析できる「GFPトラッキング法」の確立を試みた。まず、６つの膜貫通サブユニットで構成される膜タンパク質複合体であるTOM複合体に焦点を当てて研究を進めた。TOM複合体のクライオ電顕構造に基づいてGFPタグを導入するサブユニットを３つ選定し、GFPタグが溶媒側に露出するように導入位置を決定した。TOM複合体の全てのサブユニットを発現させるためのカセットベクターは既に構築済みであり、本研究ではカセットベクターの任意の位置にGFPタグを導入し、出芽酵母のゲノムに発現カセットを組み込むことで、GFP導入変異体発現株を樹立した。これらの発現株を用いてGFP導入変異体の発現スクリーニングを行ったところ、３サブユニット中２つにおいてGFPが融合したサブユニットの発現を確認し、蛍光顕微鏡観察ではGFP蛍光シグナルを捉えることにも成功した。しかし、精製TOM複合体の分子量や構成サブユニットについて、ゲルろ過クロマトグラフィーやBlue Native-PAGEを用いて評価したところ、GFPタグがTOM複合体の中に効率的に組み込まれていない可能性が考えられた。Tom22サブユニットの可溶性領域にGFPタグが導入された変異体についてはHS-AFM解析まで進めることができたが、GFPと考えられる優位なシグナルを得るには至っていない。今後は、GFPの導入位置を再検討するとともに、より小さなエピトープタグを導入した変異体の準備も並行して進めていく。

在这个研究项目中，我们将结合从冷冻电子显微镜分析获得的精确结构信息和从高速原子力显微镜（HS-AFM）分析获得的动态结构信息来研究蛋白质复合物亚基水平的动力学。建立一种易于分析的“GFP跟踪方法”。首先，我们的研究重点是TOM复合物，这是一种由六个跨膜亚基组成的膜蛋白复合物。根据TOM复合物的冷冻电镜结构，我们选择了三个亚基来引入GFP标签，并确定了引入位置，使得GFP标签暴露于溶剂侧。目前已经构建了表达TOM复合体所有亚基的盒式载体，本研究通过在盒式载体的任意位置引入GFP标签，并将表达盒整合到酿酒酵母基因组中，获得了表达TOM复合体所有亚基的菌株。建立了引入GFP的突变体。当我们使用这些表达菌株筛选引入GFP的突变体的表达时，我们证实了在三个亚基中的两个亚基中表达了GFP融合亚基，并且还可以通过荧光显微镜观察捕获GFP荧光信号，这是成功的。。然而，当我们使用凝胶过滤色谱和Blue Native-PAGE评估纯化的TOM复合物的分子量和组成亚基时，我们发现GFP标签可能无法有效地整合到TOM复合物中。尽管我们能够对将 GFP 标签引入 Tom22 亚基可溶性区域的突变体进行 HS-AFM 分析，但我们无法获得可被视为 GFP 的显性信号。未来，我们将重新考虑GFP引入的位置，同时制备具有更小的表位标签的突变体。