ミトコンドリア外膜トランスロケーターによるタンパク質輸送の構造・機能研究

线粒体外膜易位蛋白转运的结构和功能研究

基本信息

批准号：
15J07687
负责人：
荒磯裕平
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Kyoto Sangyo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-04-24 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

ミトコンドリアタンパク質の膜透過の分子機構を明らかにするため、ミトコンドリア外膜トランスロケータTOM複合体の立体構造解析を試みた。幾つかの酵母種について、Tom22サブユニットのC末端にヒスチジンタグを導入した酵母株からTOM複合体をアフィニティ精製する実験系を構築した（12L培養液あたり約0.1mg）。精製TOM複合体は、ネガティブ染色観察では均一な３量体を形成していることが明らかになったが、CryoEM観察においては変性や解離のためにTOM複合体粒子がほとんど観察されず、構造解析を進めることは困難であった。そこで、精製試料に架橋剤を添加し複合体の構成サブユニット間を架橋するGraFix法を適用することでTOM複合体の安定化を試みたところ、CryoEMによって比較的均一で分散性の高いTOM複合体粒子を予備的に観察することに成功した。今後は、高分解能構造決定のために試料調製や測定条件の更なる最適化を進めていく。TOM複合体の精製過程で一部解離してくるTom40サブユニットについては、回収しゲル濾過精製を行うことで単分散性の高い試料を得ることに成功した。現在は、LCP法やバイセルを用いた結晶化スクリーニングを試みている。また、酵母細胞内に終止コドンを欠失したnonstopミトコンドリアタンパク質を発現し、リボソームと新生鎖の解離を阻害することで、TOM複合体と相互作用したリボソーム・新生鎖複合体（TOM-RNC複合体）の大量調製にも成功し、単粒子解析による立体構造解析を試みた。リボソーム部分については約7オングストローム分解能のdensity mapを得たが、TOM複合体部分については局所分解能が低く構造決定には至らなかった。今後は基質ミトコンドリアタンパク質の長さや種類の最適化によって、リボソームに対するTOM複合体の配向を固定する必要がある。

为了阐明线粒体蛋白透膜的分子机制，我们尝试分析线粒体外膜转位子TOM复合物的三维结构。对于几种酵母物种，我们构建了一个从酵母菌株中亲和纯化 TOM 复合物的实验系统，其中在 Tom22 亚基的 C 末端引入了组氨酸标签（每 12 L 培养液约 0.1 mg）。通过负染色观察发现纯化的TOM复合物形成均一的三聚体，但在CryoEM观察中，由于变性和解离，观察到很少的TOM复合物颗粒，这使得结构分析难以推进。因此，我们尝试通过在纯化的样品中添加交联剂并应用GraFix方法使复合物的组成亚基之间交联来稳定TOM复合物，我们成功地对身体颗粒进行了初步观察。未来，我们将继续进一步优化样品制备和测量条件，以实现高分辨率结构测定。对于在TOM复合物纯化过程中部分解离的Tom40亚基，我们通过凝胶过滤收集和纯化，成功获得了高度单分散的样品。目前，我们正在尝试使用LCP方法和bicelles进行结晶筛选。此外，通过在酵母细胞中表达缺乏终止密码子的不间断线粒体蛋白并抑制核糖体和新生链的解离，还成功制备了与TOM复合物相互作用的核糖体-新生链复合物（TOM-RNC复合物）。大量的，并尝试使用单粒子分析来分析三维结构。核糖体部分获得了分辨率约为7埃的密度图，但TOM复合体部分的局部分辨率太低，无法确定其结构。未来，有必要通过优化底物线粒体蛋白的长度和类型来固定TOM复合物相对于核糖体的方向。