利用GBP-GFP高亲和系统解析裂殖酵母monopolin复合体的多重功能

The fission yeast monopolin complex (i.e. Pcs1/Mde4 protein complex) localizes at multiple loci during mitotic cell cycle, indicating its multiple functions. Previous studies showed Pcs1/Mde4 at kinetochores can recruit condensin and inhibit merotelic attachment between sister chromatids and spindle microtubules. It is still controversial whether merotelic attachments activate spindle assembly checkpoint (SAC). Pcs1/Mde4 also localize inside nucleolus, but its nucleolar function remains unclear. The potential functional connection between nucleolar Pcs1/Mde4 and condensin has not been studied. Our preliminary results showed that the absence of Pcs1/Mde4 leads to SAC silencing defects and more frequent recombination events between rDNA repeats. In contrast to condensin mutants, which show rDNA silencing defects, our results showed that Pcs1 and Mde4 are not required for rDNA silencing. We have constructed a GBP-TEV fusion carrying GFP-binding protein (GBP) and tobacco etch virus (TEV) protease, which can bind GFP/CFP/YFP-tagged proteins and cleave proteins with TEV recognizing sites. In this project, we intend to dissect the functions of fission yeast monopolin complex in SAC activation or silencing and rDNA repeat maintenance, using the newly developed GBP-GFP high affinity system.

裂殖酵母monopolin复合体(即Pcs1/Mde4蛋白复合体)在有丝分裂细胞中定位在多处，暗示其多重功能。已有研究发现，定位在动粒处的Pcs1/Mde4负责招募集缩素(condensin)蛋白，并参与抑制姐妹染色单体merotelic连接(一个着丝粒同时受到来自两极的纺锤体微管牵引)，但这种错误连接是否激活纺锤体组装检验点(SAC)尚存争议。Pcs1/Mde4还定位于核仁内，其功能尚不清楚，其是否与核仁内集缩素蛋白功能相关也未见报道。我们的前期结果显示，Pcs1/Mde4缺失导致SAC沉默缺陷，还会引起rDNA重组增加，但仍能维持rDNA区转录沉默，而集缩素突变体则解除rDNA区转录沉默。本项目拟利用GBP-GFP高亲和系统，通过GBP与烟草蚀纹病毒蛋白酶的融合蛋白(GBP-TEV)分别特异降解动粒处或核仁内的Pcs1/Mde4，解析其参与SAC以及维持rDNA拷贝数稳定的分子机制。

裂殖酵母中的monopolin复合体(即Pcs1/Mde4蛋白复合体)在有丝分裂细胞中呈现多个亚细胞定位，如动粒、纺锤体微管、以及核仁，暗示了这个复合体潜在的多重功能。.在本研究中，我们重点研究了定位在动粒及核仁处的monopolin复合体蛋白的功能。我们利用GBP-GFP高亲和系统特异性地降解动粒处的Pcs1/Mde4蛋白，发现裂殖酵母中的Monopolin complex关键组分Pcs1和Mde4缺失后可以引起纺锤体组装检验点(spindle assembly checkpoint, SAC)激活。而pcs1Δ和mde4Δ缺失突变体中由merotelic attachment (一个着丝粒同时受到来自两极的纺锤体微管牵引)带来的lagging chromosomes会造成纺锤体组装检验点的沉默延迟。这些结果说明，pcs1和mde4突变体中姐妹染色单体的merotelic连接方式是可以激活纺锤体组装检验点的，但是，这会放缓纺锤体组装检验点的沉默以便细胞纠正错误连接方式。.通过细胞生物学定位研究以及生化分析，我们发现集缩素(condensin)蛋白与monopolin复合体在动粒处存在共定位和相互作用，而且，动粒区域集缩素缺陷导致SAC持续激活，这种SAC持续激活依赖于SAC关键蛋白Bub1和Mad2。另外，我们还发现在集缩素突变体中，结合在后期促进复合物(anaphase promoting complex, APC/C)上的SAC关键蛋白Mad2和Mad3的量会增加，说明SAC持续激活很可能通过直接结合并抑制APC/C的活性实现。.我们还利用GBP-GFP高亲和系统特异性地切割核仁内定位的Pcs1蛋白，发现这会导致菌株产生HU和TBZ双重敏感性，这可能与monopolin复合体参与核仁内rDNA重组抑制、rDNA重复序列拷贝数的维持有关。.综上所述，本研究通过分别干扰monopolin复合体在动粒处和核仁内的功能，发现了其定位与功能之间的直接对应关系，不同的定位可能分别由不同的定位机制来调控，以便实现在特定细胞亚结构处的特定功能。

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