受容体よりアダプター分子Shcを介する増殖、アポトーシス、分化シグナル伝達の解析

受体分子Shc介导的增殖、凋亡和分化信号转导分析

• 批准号: 08680757
• 负责人: 後藤 典子
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08680757/
• 关键词: アダプター; Shc; Myc; アポトーシス; 細胞増殖; チロシンリン酸化

1.(1)EGF-Rチロシンキナーゼにより、Shcを基質としてin vitroでリン酸化させ、二次元マッピングを行い、Shcの主要なチロシンリン酸化部位は、Y239,Y240,Y317の三つであることを明らかとした。これは、in vivoにおいても確認した。Shcを介する経路を選択的に活性化する、自己リン酸化部位を欠失したEGF-R変異体発現細胞に、Y317FShcまたY239/240FShcを発現させると、EGFによる増殖刺激がはいらなくなった。Ras/MAPKの活性化は、Y317FShc発現細胞は起こせなくなったが、Y239/240FShc発現細胞は、十分に起こせた。一方、C-mycの誘導は、Y317FShc発現細胞は、十分に誘導できたが、Y239/240FShc発現細胞は、抑制されていた。(2)我々は、IL-3によるアポトーシスを抑制するシグナルに、Shcが関与するという結果を得ていたので、見い出したリン酸化部位の関与を調べるため、IL-3依存性BaF/3細胞にShc変異体を発現させた。Y317FShc発現細胞は、アポトーシスを十分に抑制したが、Y239/240FShc発現細胞は、IL-3存在下でもアポトーシスに陥りやすく、c-mycの誘導が抑制された。現在、その下流を解析中である。以上より、Shcの新しいリン酸化部位Y239/240は、EGFによる増殖、またIL-3によるアポトーシスの抑制に重要な未知のシグナル伝達系を活性化し、一部にはc-mycの誘導を起こすことを明らかとした。現在、tet systemにて誘導的にShc変異体をPC12細胞、A431細胞に発現させ、解析している。2.ShcととEGF-Rキナーゼドメインとの融合遺伝子(ER-S)を作り、Grb2との相互作用を、yeast-two hybrid法により調べ、相互作用が起きることが示された。このことは、ER-SのShcの部分が本来の部位にリン酸化を受けており、リン酸化したShcと相互作用する分子を固定することが可能であることを示す。ER-Sをbaitにして、human fetal cDNA libraryをスクリーニングし、新規分子をクローニングし、解析中である。3.様々な組織での発現を期待できるCAGプロモーターの下流、またCre-loxシステムにより全身、さらに部位特異的に発現させられるベクターにY239/240/317F She cDNAをつなぎ、トランスジェニックマウスを作製中である。4.Shcは、増殖因子だけでなく、様々なリガンドによりリン酸化されることが報告されてきている。我々の見い出した未知のシグナル伝達系がこれらの系において、また個体レベルで、どのような役割をもつのか、またそこに関与する分子はどんなものであるかが、現在注目され、重要な課題になっている。

1. (1) EGF-R酪氨酸激酶体外磷酸化Shc，二维图谱显示Shc上存在三个主要酪氨酸磷酸化位点：Y239、Y240和Y317。这在体内也得到了证实。当 Y317FShc 或 Y239/240FShc 在表达缺乏选择性激活 Shc 介导途径的自磷酸化位点的 EGF-R 突变体的细胞中表达时，不再需要 EGF 的生长刺激。尽管表达Y317FShc的细胞不再能够激活Ras/MAPK，但表达Y239/240FShc的细胞能够完全激活Ras/MAPK。另一方面，C-myc在Y317FShc表达细胞中被充分诱导，但在Y239/240FShc表达细胞中被抑制。 (2)由于我们已经获得Shc参与抑制IL-3诱导的细胞凋亡的信号的结果，因此我们研究了通过将IL-3依赖性BaF/3细胞注射到Shc中而发现的磷酸化位点的参与表达了突变体。 Y317FShc表达细胞充分抑制细胞凋亡，而Y239/240FShc表达细胞即使在IL-3存在下也容易发生细胞凋亡，并且c-myc诱导被抑制。我们目前正在分析其下游。综上所述，Shc的新磷酸化位点Y239/240激活了对抑制EGF诱导的增殖和IL-3诱导的细胞凋亡很重要的未知信号转导系统，并部分诱导了c-myc诱导。目前，我们正在使用 tet 系统在 PC12 细胞和 A431 细胞中诱导表达 Shc 突变体并对其进行分析。 2.我们创建了Shc和EGF-R激酶结构域之间的融合基因（ER-S），并使用酵母-二杂交方法检测了其与Grb2的相互作用，结果表明存在相互作用。这表明ER-S的Shc部分在其原始位点被磷酸化，并且可以固定与磷酸化Shc相互作用的分子。使用 ER-S 作为诱饵，我们目前正在筛选人类胎儿 cDNA 文库、克隆新分子并对其进行分析。 3. 通过将 Y239/240/317F She cDNA 连接到载体来创建转基因小鼠，该载体可以通过 Cre-lox 系统和 CAG 启动子下游进行系统和位点特异性表达，预计将在各种组织中表达。 这是。 4.Shc 据报道不仅被生长因子磷酸化，而且还被各种配体磷酸化。我们发现的未知信号转导系统在这些系统中以及在个体水平上发挥什么作用，以及涉及哪些分子，已经成为目前引起关注并成为重要的问题。

项目成果

HASEGAWA,H.: "DOCK180,a major CRK-binding protein,alters cell morphology upon translocation to the cell membrane" Mol.Cell.Biol.16. 1770-1776 (1996)

HASEGAWA, H.：“DOCK180 是一种主要的 CRK 结合蛋白，在易位至细胞膜后改变细胞形态”Mol.Cell.Biol.16。

GOTOH,N.: "A novel pathway from phosphorylation of tyrosine residues 239/240 of Shc,contributing to suppress apoptosis by IL-3" EMBO J.15. 6197-6204 (1996)

GOTOH,N.：“Shc 酪氨酸残基 239/240 磷酸化的新途径，有助于通过 IL-3 抑制细胞凋亡”EMBO J.15。