受容体より、アダプター分子Shcを介する増殖及びアポトーシスシグナル伝達の解析

受体接头分子Shc介导的增殖和凋亡信号转导分析

• 批准号: 07780618
• 负责人: 後藤 典子
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780618/
• 关键词: アダプター分子; Shc; myc; アポートシス; IL3受容体; EGF受容体; 細胞増殖

本年度の大きな成果のひとつは、Shcの主要なチロシンリン酸化部位として、Grb2結合部位であるY317の他に、Grb2と結合しないY239/240を新たに同定し、Ras-independentなShe-Myc pathwayが、この部位のリン酸化から発することを明らかとしたことである。Shc-Myc pathwayは未知のシグナル伝達系であり、さらに解明していくことが今後の課題である。1 IL-3によるアポトーシス抑制シグナル伝達Shcのチロシンリン酸化部位の変異体をBa/F3細胞に発現させた。She-Ras pathwayをなくしたY317F Shc発現細胞は、アポトーシス抵抗性であったが、Y239/240F Shc発現細胞は、c-myc mRNAが減少し、アポトーシスに陥りやすかった。アポトーシスの抑制には、Y239/240-myc pathwayが重要であった。このpathwayの下流として、bcl family, ICE family, P53等の発現について、さらに詳細な検討を加えたい。2. EGFによる細胞増殖シグナル伝達(1)免疫沈降したEGF-Rによって、GST-Shcをin vitroでリン酸化させたのち、二次元tryptic mappingを行い、Shcの主要なチロシンリン酸化部位として、新たにY239/240を同定し、in vivoでも同様にリン酸化されることを確認した。(2) Shc変異体をEGR-R高発現細胞へ発現させた。Y317F ShcまたY239/240F She発現細胞は、EGFによる増殖刺激を抑制しなかった一方、Y239/240/317F Shc発現細胞は、抑制した。EGFによる増殖シグナル上では、Shc-Ras pathwayとShc-Myc pathwayが、相補的に関与していることを示唆した。3. Shc下流因子のクローニングEGF-Rの自己リン酸化部位を欠失したcDNAとShcのチロシンリン酸化部位を含むcDNA断片とをつないだキメラcDNAを作製し、バクロウイルス発現系により、大量に発現させ、精製した。これを[32P]-γATPを用いて高い比活性でチロシンリン酸化させ、ヒト胎盤より作ったλgt11発現ライブラリーをwest-western法によりスクリーニングし、ポジティブクローンを得ている。これらの核酸配列を決定し、全長cDNAをクローニングし、Shc-Myc pathwayを直接つなぐ分子としての可能性を含め、詳細に解析したい。

今年的主要结果之一是，除了Y317（GRB2结合位点）外，SHC的主要酪氨酸磷酸化位点，Y239/240（Y239/240）与GRB2不结合，以及Y317，以及Y317，以及Y317，Y317与GRB2没有结合，从而揭示了ras-tepentented Sheeptration atter-at-tite thttht thttht thtthe Indiented patheration farction flacked patherory farcty pathory in phocked phosped patherory shiped pathercation。 SHC-MYC途径是一个未知的信号转导系统，进一步阐明将是未来的挑战。 1。在BA/F3细胞中表达了IL-3 A突变体在SHC酪氨酸磷酸化位点的凋亡信号传导。消除SHE-RAS途径的Y317F表达SHC的细胞对凋亡具有抗性，而Y239/240F表达SHC的细胞降低了C-MYC mRNA，并且更有可能陷入凋亡。 Y239/240-MYC途径对于抑制凋亡很重要。我们想进一步研究该途径下游BCL家族，ICE家族，P53等的表达。 2。通过免疫沉淀的EGF-R磷酸化在体外EGF-R磷酸化后通过EGF（1）进行细胞增殖信号传导，进行了二维胰蛋白酶映射，以鉴定Y239/240作为SHC的主要酪氨酸磷酸化位点，并确认它也是磷酸化的。 （2）在EGR-R表达高的细胞中表达SHC突变体。 Y317F SHC和Y239/240F表达表达的细胞不会抑制EGF的增殖刺激，而Y239/240/317F表达SHC的细胞则做到了。在EGF诱导的增殖信号上，SHC-RAS途径和SHC-MYC途径涉及互补。 3. SHC下游因子的克隆制备了嵌合cDNA，该嵌合cDNA与含有SHC的酪氨酸磷酸化位点的cDNA片段相连，并使用Bacrovirus表达系统大量表达并纯化。这是使用[32p]-γATP高特异性活性磷酸化的酪氨酸，并通过西方方法筛选了从人胎盘产生的λGT11表达式文库，以获得阳性克隆。我们想确定这些核酸序列，克隆全长cDNA，并详细分析它们，包括成为直接连接SHC-MYC途径的分子的可能性。

项目成果

N. Gotoh et. al.: "The SH2 domain of Shc suppresses EGF-induced mitogenesis in a dominant negative manner" Oncogene. 11. 2525-2533 (1995)

N. Gotoh 等。