レトロウイルスcDNA発現ライブラリーによる未知のヒト白血病原因遺伝子の探索

使用逆转录病毒 cDNA 表达文库搜索未知的人类白血病致病基因

基本信息

批准号：
09877205
负责人：
野阪哲哉
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09877205/
关键词：
白血病 cDNA発現ライブラリーレトロウイルス STAT5 癌遺伝子

项目摘要

我々はヒト白血病に関る未知の癌遺伝子をfunctional assayにて単離することを目的に、研究を開始した。まず、急性骨髄性白血病患者由来で第7染色体が片方欠落した(Mono-somy7)核型をもつ新規細胞株(中畑龍俊研究室で樹立)よりmRNAを抽出、レトロウイルスcDNA発現ライブラリーを作製し、IL-3依存性細胞株Ba/F3に遺伝子導入し、癌化責任遺伝子の単離を試みたが、現在までのところIL-3非依存性に増殖するcloneは得られていない。一方、我々は、PCR directed random mutagenesisとレトロウイルス発現システムを組合せて、マウスにおける転写因子STAT5の恒常的活性型を3種類、Ba/F3細胞を用いて同定した。興味深いことに、上記3種の恒常的活性型STAT5は、IL-3非依存性にBa/F3細胞を増殖させる反面、IL-3存在下では逆に、分化またはアポトーシスを誘導することが判明した。これらの表現型は、STAT5の下流の種々の遺伝子のうち、どの遺伝子が活性化されるかによって規定されていた。これらの実験系は、野生型のSTAT5の生物学的役割を考える上でも有用である。最近、ある種のヒト白血病はTEL-JAK2キメラ遺伝子形成によるJAK2の活性化が原因であることが報告されたが、種々のヒト白血病患者細胞におけるSTAT3、5の恒常的活性化は周知の事実である。したがって、STAT5のリン酸化が亢進している患者サンプルを解析し、その原因がSTAT5そのものの構造異常によるものなのか、STAT5より上流のシグナルが持続的にonの状態になっているためなのかを明らかにする目的で、患者細胞由来STAT5遺伝子をレトロウイルスを用いてBa/F3細胞において発現させ、IL-3非依存性に増殖するcloneが得られるか否か、検討中である。これまでのところ患者細胞由来のSTAT5遺伝子に突然変異は見つかっていない。

我们开始研究的目的是使用功能测定分离与人类白血病相关的未知癌症基因。首先，从核型缺失1条7号染色体的急性髓性白血病患者（Mono-somy7）的新细胞系（中畑达俊实验室建立）中提取mRNA，并创建逆转录病毒cDNA表达文库。我们试图通过将基因导入IL-3依赖性细胞系Ba/F3来分离负责癌变的基因，但迄今为止尚未获得以不依赖IL-3的方式增殖的克隆。同时，通过结合 PCR 定向随机诱变和逆转录病毒表达系统，我们在 Ba/F3 细胞中鉴定了小鼠体内转录因子 STAT5 的三种组成型活性形式。有趣的是，发现上述三种组成型活性STAT5以不依赖IL-3的方式引起Ba/F3细胞增殖，但相反，它们在IL-3存在的情况下诱导分化或凋亡。这些表型由 STAT5 下游各种基因中哪些基因被激活决定。这些实验系统对于考虑野生型 STAT5 的生物学作用也很有用。最近，据报道，某些类型的人类白血病是由 TEL-JAK2 嵌合体基因形成引起的 JAK2 激活引起的，但众所周知，STAT3 和 STAT5 在各种人类白血病患者细胞中持续激活。因此，我们分析了 STAT5 磷酸化增加的患者样本，并确定这是由于 STAT5 本身的结构异常还是由于 STAT5 上游信号持续处于开启状态。目前正在研究是否可以通过使用逆转录病毒在 Ba/F3 细胞中表达患者细胞衍生的 STAT5 基因来获得独立于 IL-3 增殖的克隆。到目前为止，尚未发现源自患者细胞的STAT5基因发生突变。