メタゲノム法を用いた生物活性物質、遺伝子、酵素の探索

使用宏基因组方法寻找生物活性物质、基因和酶

基本信息

批准号：
12F02032
负责人：
阿部郁朗
金额：
$ 1.47万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012 至 2013
项目状态：
已结题

项目摘要

海洋生物に共生する微生物は様々な二次代謝産物を産生すると考えられているが、これらの多くは人工的に培養することが困難である。そこで、新たな物質探索の手段として、有用物質を生産している海綿など、難培養性の海洋生物共生微生物の遺伝子を直接的に抽出したメタゲノムライブラリーを構築し、これを大腸菌等をホストとして、二次代謝産物の生合成遺伝子を発現させ、様々な生理活性物質の生産を指標にしたスクリーニングで有望株を選別することで、有用物質生産につなげる研究を進めている。この生産系を利用して、培地に人工基質を添加してやればPrecursor-Directed Biosynthesisへの展開が可能であり、また、化合物の構造次第では、新規酵素の発見にも繋がり、遺伝子工学やタンパク工学、酵素工学へ展開が期待できる。今回我々は、カリクリンを生産する海綿Discodermia calyxのメタゲノムより調製したフォスミド・ライブラリーを用いて、これを大腸菌において異種発現させ、抗菌活性を指標としたスクリーニングで有望株の選抜を行い、複数のクローンの取得に成功した。選抜したクローンについて、大量培養により抗菌活性物質を精査した結果、新規ポルフィリン。インドール・ハイブリッド型化合物、新規糖脂質など、いくつかの新規抗菌活性物質の単離構造決定に成功した。ポルフィリン・インドール・ハイブリッド型化合物生産クローンに導入されたDNA配列を次世代シーケンサーにて決定し、それらのうちポルフィリン生合成に関わるhemABC遺伝子が、その生合成に必須であることを同定した。この情報を元に、インドールからポルフィリンのvinyl基へ求核攻撃が起きることによってポルフィリン・インドール・ハイブリッド化合物が生産される新規な合成経路を提唱した。

与海洋生物共生的微生物被认为能产生多种次生代谢产物，但其中许多难以人工培养。因此，作为寻找新物质的一种手段，我们构建了一个宏基因组库，直接提取难以培养的海洋共生微生物的基因，例如海绵，我们正在继续进行研究，这将导致产生有用的物质。通过表达次生代谢物生物合成的基因来生产有用物质，并以各种生理活性物质的产生为指标进行筛选，选择有前途的菌株。通过使用这种生产系统并向培养基中添加人工底物，可以将其发展为前体定向生物合成，而且，根据化合物的结构，它可以导致新酶的发现，从而导致新酶的发现。基因工程、蛋白质工程等。我们可以预期它会扩展到酶工程。本研究利用产花萼蛋白海绵Discodermia calyx的宏基因组制备的fosmid文库，在大肠杆菌中异源表达，以抗菌活性为指标筛选出有前景的菌株，并成功获得多个克隆。通过大规模培养检查所选克隆的抗菌活性物质，结果发现了一种新的卟啉。我们已成功分离并确定了多种新型抗菌活性物质的结构，包括吲哚杂化化合物和新型糖脂。使用下一代测序仪测定了导入卟啉-吲哚杂合化合物生产克隆中的DNA序列，其中，参与卟啉生物合成的hemABC基因被鉴定为生物合成所必需的。基于这些信息，我们提出了一种新的合成路线，通过吲哚对卟啉乙烯基的亲核攻击产生卟啉-吲哚杂化化合物。