微細藻由来トリテルペン合成酵素の構造機能解析

微藻三萜合酶的结构和功能分析

基本信息

批准号：
12F02331
负责人：
阿部郁朗
金额：
$ 0.77万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012 至 2013
项目状态：
已结题

项目摘要

ボツリオコッセンはスクアレンに類似し、ファルネシル二リン酸を基質として生合成されるが、その生成メカニズムはスクアレンとは異なっている。特定されたボツリオコッセン合成酵素遺伝子情報を利用し、ボツリオコッセン合成酵素およびスクアレン合成酵素のX線結晶構造解析を行い、本酵素の構造的特徴と炭化水素生産機構の解明をめざす。今回、我々は、微細藻Botryococcus braunii由来ボッリオコッセン合成酵素について、遺伝子のコドン改変およびタンパク質発現大腸菌の株の選択により、結晶化に必要な量の組換えタンパク質の得られる系を確立した。また、すでに結晶構造が明らかになっているヒト由来スクアレン合成酵素(SS)を鋳型としてSSL-1～3のホモロジーモデルを作成した結果、SSの72番目および288番目のフェニルアラニン、204番目のアラニンに相当するSSL-1～3の活性中心キャビティ構成アミノ酸残基が、各酵素の基質特異性と生成物特異性の制御に重要な役割を演じている可能性が示された。そこで活性中心キャビティの形状や容積を変化させることを目的とし、SSL-1～3における当該アミノ酸残基をグリシンやアラニン、セリンなどに置換した点変異体を各々設計し、これらの変異酵素を作成した。現在これら変異の導入が酵素活性に及ぼす影響について精査しているところでる。また、これら組み換え酵素を用いて、各タンパク質の結晶化の条件の検討に着手した。

葡萄球烯与角鲨烯类似，都是以法呢基二磷酸为底物生物合成的，但其生产机制与角鲨烯不同。利用已鉴定的葡萄烯合酶基因信息，我们将对葡萄烯合酶和角鲨烯合酶进行X射线晶体结构分析，旨在阐明该酶的结构特征和产烃机制。在这项研究中，我们建立了一个系统，通过修改基因的密码子并选择表达该蛋白质的大肠杆菌菌株，获得来自微藻布氏葡萄球菌的硼酸合酶结晶所需的重组蛋白质的量。另外，以晶体结构已明确的人源角鲨烯合酶(SS)为模板，制作了SSL-1～3的同源模型，结果发现72位和288位的苯丙氨酸、 SS 204位丙氨酸表明构成SSL-1至SSL-3活性中心空腔的相应氨基酸残基可能在控制各酶的底物特异性和产物特异性中发挥重要作用。因此，为了改变活性中心腔的形状和体积，我们设计了点突变体，将SSL-1至3中的相关氨基酸残基替换为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等，并创建了这些突变体酶做到了。我们目前正在研究引入这些突变对酶活性的影响。此外，使用这些重组酶，我们开始研究每种蛋白质结晶的条件。