Analysis of new regulatory mechanism of protein deamidation and it's functional using oral cancer cells

蛋白质脱酰胺新调控机制及其在口腔癌细胞中的功能分析

基本信息

批准号：
21K19609
负责人：
自見英治郎
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-07-09 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21K19609/
关键词：
脱アミド化口腔扁平上皮癌 NF-κB NF-kB

项目摘要

タンパク質の機能は、立体構造の変化によって調節される。特定アミノ酸残基のリン酸化やアセチル化、アミド化などの翻訳後修飾は、重要なタンパク質の機能調節系である。タンパク質のアミド基を取り除く脱アミド化反応は、長い間、徐々に進行する酵素に依存しない「化」と考えられてきた。しかし、ある種の免疫系タンパク質の短時間に起こる脱アミド化が、がん細胞や微生物による免疫回避に重要な役割を果たす、という新たなモデルが提唱された。近年、転写因子NF-κBのメインサブユニットであるp65の64番目および139番目のアスパラギン（N）が脱アミド化（アスパラギン酸へ変異：D）することが報告されたが、その機能は不明な点が多い。まず、p65の脱アミド化部位（N64D, N139D）を含むペプチドを抗原として、脱アミド化p65 を特異的に認識する抗体を作製した。N64Dに対する抗体は特異性が著しく低く作製できなかったが、N139Dに対する抗体を得ることができた。しかし、N139Dだけでなく野生型p65も認識してしまうので、現在抗体の希釈濃度を検討中である。FLAG TagおよびGFPを融合したp65変異体（N64D, N139D, および2つの変異を持つDD）を作製して転写活性を調べた。N64Dは野生型と殆ど変化しなかったが、N139Dは転写活性が40%まで低下した。DDは転写活性が25%まで低下したが、DD変異体の発現そのものが著しく低下しており、DDの転写活性の低下は発現量の低下に起因すると考えられた。現在、２種類のマウスがん細胞（SCCVII細胞、およびB16細胞）の内在性のp65をゲノム編集でノックアウトし、野生型およびp65変異体を恒常的に発現する細胞株を樹立中である。

蛋白质的功能受构象变化的调节。翻译后修饰，例如磷酸化，乙酰化和特异性氨基酸残基的抑制作用是重要的蛋白质功能调节系统。长期以来，去除蛋白质中去除酰胺基的脱胺反应被认为是“独立于酶的”，其进展缓慢。然而，已经提出了一个新模型，某些免疫蛋白的短期脱氨基在癌细胞和微生物的免疫逃避中起重要作用。近年来，据报道，在P65（转录因子NF-κB的主要亚基）位置上的天冬酰胺（n）是脱酰胺（天冬氨酸突变：D）的主要亚基，但其功能尚不清楚。首先，使用含有p65（N64D，N139D）脱氨基位点的肽制备了专门识别脱酰胺的p65的抗体。尽管针对N64D的抗体明显较少，并且无法产生，但获得了针对N139D的抗体。但是，由于它不仅识别N139D，而且识别野生型P65，因此我们目前正在研究抗体的稀释浓度。与FLAG TAG和GFP（N64D，N139D和DD和两个突变的DD）融合的P65突变体被生成以检查转录活性。 N64D与野生型几乎没有变化，但N139D将转录活性降低到40％。尽管DD将转录活性降低至25％，但DD突变体本身的表达显着降低，并且DD的转录活性的降低被认为是由于表达水平降低。目前，通过基因组编辑和组成性表达野生型和p65突变体的细胞系来淘汰两种类型的小鼠癌细胞（SCCVII细胞和B16细胞）的内源性p65。