Analysis of new regulatory mechanism of protein deamidation and it's functional using oral cancer cells

蛋白质脱酰胺新调控机制及其在口腔癌细胞中的功能分析

基本信息

批准号：
21K19609
负责人：
自見英治郎
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-07-09 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21K19609/
关键词：
脱アミド化口腔扁平上皮癌 NF-κB NF-kB

项目摘要

タンパク質の機能は、立体構造の変化によって調節される。特定アミノ酸残基のリン酸化やアセチル化、アミド化などの翻訳後修飾は、重要なタンパク質の機能調節系である。タンパク質のアミド基を取り除く脱アミド化反応は、長い間、徐々に進行する酵素に依存しない「化」と考えられてきた。しかし、ある種の免疫系タンパク質の短時間に起こる脱アミド化が、がん細胞や微生物による免疫回避に重要な役割を果たす、という新たなモデルが提唱された。近年、転写因子NF-κBのメインサブユニットであるp65の64番目および139番目のアスパラギン（N）が脱アミド化（アスパラギン酸へ変異：D）することが報告されたが、その機能は不明な点が多い。まず、p65の脱アミド化部位（N64D, N139D）を含むペプチドを抗原として、脱アミド化p65 を特異的に認識する抗体を作製した。N64Dに対する抗体は特異性が著しく低く作製できなかったが、N139Dに対する抗体を得ることができた。しかし、N139Dだけでなく野生型p65も認識してしまうので、現在抗体の希釈濃度を検討中である。FLAG TagおよびGFPを融合したp65変異体（N64D, N139D, および2つの変異を持つDD）を作製して転写活性を調べた。N64Dは野生型と殆ど変化しなかったが、N139Dは転写活性が40%まで低下した。DDは転写活性が25%まで低下したが、DD変異体の発現そのものが著しく低下しており、DDの転写活性の低下は発現量の低下に起因すると考えられた。現在、２種類のマウスがん細胞（SCCVII細胞、およびB16細胞）の内在性のp65をゲノム編集でノックアウトし、野生型およびp65変異体を恒常的に発現する細胞株を樹立中である。

蛋白质功能由构象变化调节。特定氨基酸残基的磷酸化、乙酰化和酰胺化等翻译后修饰是蛋白质功能的重要调节系统。脱酰胺作用可以从蛋白质中去除酰胺基团，长期以来一直被认为是一种渐进的、不依赖于酶的“化学反应”。然而，人们提出了一种新模型，其中某些免疫系统蛋白的快速脱酰胺在癌细胞和微生物的免疫逃避中发挥着重要作用。最近有报道称，转录因子NF-κB的主要亚基p65的64位和139位的天冬酰胺（N）发生脱酰胺化（突变为天冬氨酸：D），但其功能尚不清楚。点。首先，使用含有p65的脱酰胺位点(N64D、N139D)的肽作为抗原，制备特异性识别脱酰胺化p65的抗体。虽然由于特异性极低而无法产生针对 N64D 的抗体，但我们能够获得针对 N139D 的抗体。然而，由于它不仅识别N139D，还识别野生型p65，因此我们目前正在考虑抗体的稀释浓度。我们创建了与 FLAG 标签和 GFP 融合的 p65 突变体（N64D、N139D 和具有两个突变的 DD）并检查了它们的转录活性。 N64D 与野生型相比几乎没有变化，但 N139D 的转录活性降低了高达 40%。虽然DD的转录活性降低至25%，但DD突变体本身的表达显着降低，表明DD转录活性的降低是由于表达水平的降低所致。我们目前正在通过基因组编辑敲除两种类型的小鼠癌细胞（SCCVII 细胞和 B16 细胞）中的内源性 p65，并建立组成型表达野生型和 p65 突变体的细胞系。