破骨細胞の転写調節因子NF-κBによるインターロイキン6遺伝子発現機構の解析

破骨细胞转录因子NF-κB分析白细胞介素6基因表达机制

基本信息

批准号：
08771621
负责人：
自見英治郎
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Showa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08771621/
关键词：
破骨細胞インターロイキン(IL-1)-1 NF-κB IL-6 ゲルシフトアッセイ p50 p65 免疫染色

项目摘要

マウス骨芽細胞と骨髄細胞の共存培養によって得られた破骨細胞様細胞(破骨細胞)を用いてインターロイキン6(IL-6)遺伝子の発現機構の解析を試みた。1.破骨細胞のNF-κB様因子の性状の解析ゲルシフトアッセイにおいて、IL-1によって活性化される破骨細胞のNF-κB様因子は骨芽細胞のNF-κBより分子量の小さな単一のバンドとして認められた。そこで、NF-κBを構成するp50,p65,c-Rel,Rel B及びp52に対する抗体を用いてスパーシフトアッセイを行い両者の組成の違いを検討した。その結果、骨芽細胞のNF-κBはp50-p50のホモダイマー、及びp50-p65のヘテロダイマーとして検出された。これに対し、破骨細胞のNF-κB様因子はp50に対する抗体でバンドの大部分が、p65に対する抗体でその一部がスーパーシフトしたが他のサブユニットに対する抗体には反応しなかった。このことから破骨細胞のNF-κB様因子はp50及びp65関連蛋白から構成されていることが判った。さらに、p65に対する抗体で免疫染色を行ったところ、IL-1刺激後30分で破骨細胞の全ての核にp65が移行することが判った。2.破骨細胞のIL-6mRNA発現の解析破骨細胞及び骨芽細胞をIL-1で刺激、非刺激した後に全RNAを抽出し、IL-6 cDNAプローブを用いてノーザンブロット法により破骨細胞と骨芽細胞のIL-6mRNA量を比較検討した。骨芽細胞ではIL-1刺激後1時間で非刺激の約10倍IL-6のmRNAの上昇が認められ、NF-κBの活性化を阻害するTPCKの前処理によってIL-6のmRNAの上昇は抑制された。一方、破骨細胞ではIL-6のmRNAの発現は検出限界以下であった。RT-PCR法で刺激後1時間でわずかな上昇が認められた。以上のことから、破骨細胞は骨芽細胞と同様にIL-1刺激によってNF-κBの核への移行が起こっているにもかかわらず、少なくとも破骨細胞が骨芽細胞よりも多くのIL-6を産生する可能性は低いと考えられた。

我们尝试使用小鼠成骨细胞和骨髓细胞共培养获得的破骨细胞样细胞（破骨细胞）来分析白细胞介素6（IL-6）基因的表达机制。 1.破骨细胞中NF-κB样因子的性质分析在凝胶迁移实验中，IL-1激活的破骨细胞中的NF-κB样因子是一种比成骨细胞中的NF-κB分子量更小的单一蛋白质。一支乐队。因此，我们使用针对构成 NF-κB 的 p50、p65、c-Rel、Rel B 和 p52 的抗体进行了刺激位移测定，以检查其组成的差异。结果，成骨细胞中的NF-κB被检测为p50-p50同二聚体和p50-p65异二聚体。另一方面，大多数破骨细胞NF-κB样因子的条带被p50抗体超移，其中一些被p65抗体超移，但它们不与其他亚基抗体反应。这表明破骨细胞中的NF-κB样因子由p50和p65相关蛋白组成。此外，用抗p65抗体进行的免疫染色显示，在IL-1刺激后30分钟，p65被转移到破骨细胞的所有细胞核中。 2.破骨细胞中IL-6 mRNA表达的分析用IL-1刺激和非刺激破骨细胞和成骨细胞后，提取总RNA，并使用IL-6 cDNA探针通过Northern印迹分析破骨细胞的水平。细胞和成骨细胞中的 IL-6 mRNA。在成骨细胞中，与未刺激相比，IL-1 刺激后 1 小时观察到 IL-6 mRNA 增加约 10 倍，并且用抑制 NF-κB 激活的 TPCK 预处理，导致 IL-6 mRNA 增加被压制了。另一方面，在破骨细胞中，IL-6 mRNA 表达低于检测限。 RT-PCR 刺激后 1 小时观察到轻微增加。由上可知，尽管破骨细胞与成骨细胞一样，在IL-1刺激下将NF-κB转移至细胞核，但至少破骨细胞比成骨细胞产生更多的IL，但认为产生-6的可能性较低。