破骨細胞の転写調節因子NF-κBによるインターロイキン6遺伝子発現機構の解析

破骨细胞转录因子NF-κB分析白细胞介素6基因表达机制

基本信息

批准号：
08771621
负责人：
自見英治郎
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Showa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08771621/
关键词：
破骨細胞インターロイキン(IL-1)-1 NF-κB IL-6 ゲルシフトアッセイ p50 p65 免疫染色

项目摘要

マウス骨芽細胞と骨髄細胞の共存培養によって得られた破骨細胞様細胞(破骨細胞)を用いてインターロイキン6(IL-6)遺伝子の発現機構の解析を試みた。1.破骨細胞のNF-κB様因子の性状の解析ゲルシフトアッセイにおいて、IL-1によって活性化される破骨細胞のNF-κB様因子は骨芽細胞のNF-κBより分子量の小さな単一のバンドとして認められた。そこで、NF-κBを構成するp50,p65,c-Rel,Rel B及びp52に対する抗体を用いてスパーシフトアッセイを行い両者の組成の違いを検討した。その結果、骨芽細胞のNF-κBはp50-p50のホモダイマー、及びp50-p65のヘテロダイマーとして検出された。これに対し、破骨細胞のNF-κB様因子はp50に対する抗体でバンドの大部分が、p65に対する抗体でその一部がスーパーシフトしたが他のサブユニットに対する抗体には反応しなかった。このことから破骨細胞のNF-κB様因子はp50及びp65関連蛋白から構成されていることが判った。さらに、p65に対する抗体で免疫染色を行ったところ、IL-1刺激後30分で破骨細胞の全ての核にp65が移行することが判った。2.破骨細胞のIL-6mRNA発現の解析破骨細胞及び骨芽細胞をIL-1で刺激、非刺激した後に全RNAを抽出し、IL-6 cDNAプローブを用いてノーザンブロット法により破骨細胞と骨芽細胞のIL-6mRNA量を比較検討した。骨芽細胞ではIL-1刺激後1時間で非刺激の約10倍IL-6のmRNAの上昇が認められ、NF-κBの活性化を阻害するTPCKの前処理によってIL-6のmRNAの上昇は抑制された。一方、破骨細胞ではIL-6のmRNAの発現は検出限界以下であった。RT-PCR法で刺激後1時間でわずかな上昇が認められた。以上のことから、破骨細胞は骨芽細胞と同様にIL-1刺激によってNF-κBの核への移行が起こっているにもかかわらず、少なくとも破骨細胞が骨芽細胞よりも多くのIL-6を産生する可能性は低いと考えられた。

我们尝试使用通过共培养小鼠成骨细胞和骨髓细胞获得的破骨细胞样细胞（骨细胞）分析白介素6（IL-6）基因的表达机制。 1。分析凝胶转移测定中破骨细胞NF-κB样因子的性能，IL-1激活的破骨细胞NF-κB样因子是单个带，其分子量小于成骨细胞NF-κB。因此，使用针对P50，P65，C-REL，RER B和P52的抗体进行SparShift分析，该抗体构成NF-κB，以检查两者的组成差异。结果，在成骨细胞中的NF-κB被检测为P50-P50的同二聚体和P50-P65的异二聚体。相比之下，破骨细胞中的NF-κB样因子是针对P50的抗体，部分带对P65的抗体进行了超移，但对针对其他亚基的抗体没有反应性。这表明破骨细胞的NF-κB样因子由P50和P65相关蛋白组成。此外，用针对p65的抗体进行免疫染色，发现p65在IL-1刺激后30分钟转移到破骨细胞的所有核。 2。在破骨细胞成骨细胞和成骨细胞中IL-6 mRNA表达的分析用IL-1刺激，然后提取总RNA，然后使用IL-6 cdna Probe进行比较，并比较成骨细胞中的IL-6 mRNA量和成骨细胞中的IL-6 mRNA量。在成骨细胞中，观察到IL-6 mRNA的增加比未刺激的数量高约10倍，而TPCK抑制了NF-κB的激活，抑制了IL-6 mRNA的增加。另一方面，在破骨细胞中，IL-6 mRNA的表达低于检测极限。 RT-PCR刺激后1小时观察到略有增加。基于上述情况，人们认为，尽管破骨细胞经历了类似于成骨细胞的IL-1刺激，但骨细胞不太可能产生至少比成骨细胞更多的IL-6。