神経系特異的AP-3B複合体による細胞内輸送系の解明

神经系统特异性 AP-3B 复合物阐明细胞内转运系统

基本信息

批准号：
17700360
负责人：
中津史
金额：
$ 2.3万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17700360/
关键词：
アダプター(AP)複合体細胞内輸送小胞型GABA輸送体(VGAT)

项目摘要

1 AP-3Bのcargo候補分子1;VGATの細胞内局在に関する研究μ3BKOマウスではGABAの放出が顕著に低下していたことから、μ3BはSVに局在する小胞型GABA輸送体(VGAT)の輸送・局在を制御している可能性が考えられた。そこで、このVGATがμ3Bのcargoである可能性を検討した。VGATのアミノ酸配列を調べたところ、細胞質領域にジ-ロイシン(LL)・シグナル様の配列を見いだした。VGATのキメラ蛋白、及びHAタグを導入したVGATの一過性発現による解析から、このVGATのLLシグナルはエンドサイトーシス・シグナルとして機能することが判明した。またPC12細胞を用いた免疫蛍光染色から、VGATとAP-3はvesicle様構造に共局在することも判明した。さらに、VGATにN末端側細胞質領域には、C末端側のLLシグナルとは別の細胞内局在を規定する領域が存在し、別々の機構により細胞内局在が制御されていることがわかった。2 AP-3Bのcargo候補分子2;Nischarinに関する研究μ3Bをbaitにした酵母2ハイブリッド法により、新たにNischarinを単離した。HeLa細胞を用いたHA-Nischarinの一過性発現による生化学的解析により、AP-3がHA-Nischarinと共沈したことから、細胞内においても両者の相互作用が確認された。また、HA-Nischarinを強制発現した細胞では、CD63の細胞内局在に異常が見られたことから、AP-3の輸送系にNischarinは重要な役割を担っていることが明らかになった。NischarinはN末端にPXドメインを有し、それに続くcoiled-coli領域を介してエンドソームに局在することが判明していることから、NischarinはAP-3のエンドソーム膜へのリクルートにも関与している可能性が示唆された。

1 AP-3B 的候选分子 1; μ3BKO 小鼠中 VGAT GABA 释放的细胞内定位显着减少，表明 μ3B 是定位于 SV 的囊泡 GABA 转运蛋白 (VGAT)。和本地化因此，我们研究了该VGAT是否是μ3B的货物的可能性。当我们研究VGAT的氨基酸序列时，我们在细胞质区域发现了一个二亮氨酸（LL）信号样序列。使用嵌合 VGAT 蛋白和带有 HA 标签的 VGAT 瞬时表达进行的分析表明，VGAT 的 LL 信号充当内吞信号。此外，使用 PC12 细胞的免疫荧光染色显示 VGAT 和 AP-3 共定位于囊泡样结构中。此外，我们发现 VGAT 的 N 端细胞质区域中有一个区域定义了与 C 端 LL 信号分开的细胞内定位，并且亚细胞定位由不同的机制控制。 2 AP-3B 的候选分子 Nischarin 的研究以 μ3B 为诱饵，采用酵母双杂交法新分离出 Nischarin。使用 HeLa 细胞瞬时表达 HA-Nischarin 进行生化分析，结果显示 AP-3 与 HA-Nischarin 共沉淀，证实了细胞内两者之间的相互作用。此外，在强制表达HA-Nischarin的细胞中观察到CD63的异常细胞内定位，表明Nischarin在AP-3转运系统中发挥重要作用。 Nischarin 在其 N 末端具有 PX 结构域，并通过随后的卷曲大肠杆菌区域定位于核内体，这表明 Nischarin 也参与了 AP-3 向核内体膜的募集。