クライオ電子線トモグラフィーによる脂質交換輸送ゾーンの形態・機能解析

冷冻电子断层扫描脂质交换运输区的形态和功能分析

基本信息

批准号：
20KK0159
负责人：
中津史
金额：
$ 11.98万
依托单位：
Niigata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research (B))
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-10-27 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度樹立した安定発現細胞株を用いて、まずイメージング解析により脂質交換輸送ゾーンを詳細に解析し、脂質交換輸送ゾーンには極めて動的な状態のものと、比較的動きの少ない安定的なものが存在することが明らかになった。また、脂質交換輸送ゾーンにおいて共局在する脂質輸送タンパク質と、そうでない脂質輸送タンパク質とが存在することも判明した。さらに、脂質輸送タンパク質の機能欠損による脂質交換輸送ゾーンへの影響を解析したところ、脂質交換輸送ゾーン形成に大きく影響するものとそうでないものが存在していた。また、本年度も海外渡航規制のために、クライオ電子線トモグラフィー解析による超微細構造の解析を、海外において行うことができなかった。そこで、前年から着手している通常の電子顕微鏡を用いた微細構造の解析を進めた。パラホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドの混合液を用いた化学固定が最も固定状況が良好であったため、この方法を選択した。その後の工程は定法にしたがって電子顕微鏡解析のためのサンプル調整を行った。あらかじめGFP融合タンパク質として低レベルに発現させることで脂質交換輸送ゾーンを可視化しておき、これを共焦点顕微鏡により観察・データ取得を行い、電子顕微鏡観察の対象領域を事前に決定した。GFP蛍光が存在する細胞膜領域近辺に網目状の小胞体が接する領域を電子顕微鏡観察により捉えることができた。その領域を目印に、電子顕微鏡データの取得を行った。現在、複数の細胞における脂質交換輸送ゾーンの電子顕微鏡像の取得に成功している。

利用去年建立的稳定表达细胞系，我们首先通过成像分析对脂质交换转运区进行了详细分析，结果明确了它的存在。还发现存在共定位于脂质交换转运区的脂质转运蛋白和不共定位于脂质交换转运区的脂质转运蛋白。此外，当我们分析脂质转运蛋白功能缺陷对脂质交换转运区的影响时，我们发现有些对脂质交换转运区的形成有显着影响，而另一些则没有。此外，由于今年海外旅行限制，我们无法在海外使用冷冻电子断层扫描分析进行超精细结构分析。因此，我们从去年开始使用传统电子显微镜进行微观结构分析。使用多聚甲醛和戊二醛的混合物进行化学固定提供了最佳的固定效果，因此选择了这种方法。在后续步骤中，根据标准方法制备样品用于电子显微镜分析。通过将脂质交换转运区以GFP融合蛋白的形式低水平表达，预先使其可视化，使用共聚焦显微镜进行观察并获取数据，并预先确定电子显微镜观察的目标区域。我们能够通过电子显微镜观察网状内质网与存在 GFP 荧光的细胞膜区域接触的区域。使用该区域作为地标，我们获取了电子显微镜数据。目前，我们已成功获得多个细胞内脂质交换运输区的电镜图像。

项目成果

期刊论文数量（26）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Protein-recruiting synthetic molecules targeting the Golgi surface

靶向高尔基体表面的蛋白质招募合成分子

DOI：
10.1039/d0cc06908f
发表时间：
2020
期刊：
影响因子：
4.9
作者：
Sawada Shunsuke;Nakamura Akinobu;Yoshii Tatsuyuki;Kuwata Keiko;Nakatsu Fubito;Tsukiji Shinya
通讯作者：
Tsukiji Shinya

Plasma Membrane Shaping

质膜整形

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
Nakatsu F; Kawasaki A
通讯作者：
Kawasaki A

Functions of Oxysterol-Binding Proteins at Membrane Contact Sites and Their Control by Phosphoinositide Metabolism

膜接触位点氧甾醇结合蛋白的功能及其通过磷酸肌醇代谢的控制

DOI：
10.3389/fcell.2021.664788
发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
5.5
作者：
Nakatsu Fubito;Kawasaki Asami
通讯作者：
Kawasaki Asami

PI4P/PS countertransport by ORP10 at ER-endosome membrane contact sites regulates endosome fission

ORP10 在内质网膜接触位点的 PI4P/PS 反转运调节内体裂变

DOI：
10.1083/jcb.202103141
发表时间：
2022-01-03
期刊：
影响因子：
7.8
作者：
Kawasaki A;Sakai A;Nakanishi H;Hasegawa J;Taguchi T;Sasaki J;Arai H;Sasaki T;Igarashi M;Nakatsu F
通讯作者：
Nakatsu F

1.メンブレンコンタクト操作ツールを用いた脂質交換輸送の機能解明

1. 使用膜接触操作工具阐明脂质交换运输的功能