神経系特異的AP-3B複合体・μ3Bサブユニットによる細胞内輸送機構の解析

神经系统特异性AP-3B复合物和μ3B亚基的细胞内转运机制分析

基本信息

批准号：
15700299
负责人：
中津史
金额：
$ 2.18万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

μ3Bに結合するcargo候補分子としては、前年度に引き続き行っていたyeast two-hybrid解析、及びμ3B KOマウスの解析から、小胞型亜鉛トランスポーターZnT3と小胞型GABAトランスポーターVGATに焦点を絞り、解析を行った。ZnT3のC末端側、もしくはN末端側細胞質領域を、Tac(IL2受容体α鎖)及びインバリアント鎖(Ii)に繋いだキメラ蛋白質を作成し、これらをPC12細胞に発現させ、それらの局在を詳細に調べたところ、それぞれの領域にはエンドソーム、及びシナプス様小胞(SLMV)に局在するシグナルが存在することがわかった。そこで種々の変異体を用いて詳細に解析を行ったところ、それぞれの領域には異なる細胞内局在を規定するジーロイシン・シグナルが存在することが判明した。特にC末端側細胞質領域は、トランスゴルジ・ネットワーク(TGN)から細胞膜を経由せず直接エンドソーム/SLMVへの輸送を担っている事も明らかになった。そこで、ZnT3とμ3サブユニットの直接の相互作用を検討するために、GST-ZnT3蛋白質、及び精製μ3A及びμ3B蛋白質を用いてSPR解析を行った1ところ、非常にわずかではあるが特異的な結合が検出された。これらのことからAP-3A/Bは、ZnT3のC末端側細胞質領域に結合し、TGNから直接エンドソーム/SLMVへの輸送に関与する可能性が考えられる。VGATに関してもZnT3と同様なキメラ蛋白を用いて解析を行ったところ、N末側、及びC末側に細胞内局在を規定するシグナルの存在を確認した。特にC末側にはジーロイシン様シグナルが存在し、VGATのエンドサイトーシス、及び細胞内局在に関与する事が明らかになった。

作为与μ3B结合的货物候选分子，我们从去年继续进行的酵母二杂交分析和μ3B KO小鼠的分析中重点关注了囊泡锌转运蛋白ZnT3和囊泡GABA转运蛋白VGAT，进行了分析。我们创建了一种嵌合蛋白，将 ZnT3 的 C 端或 N 端胞质区域连接到 Tac（IL2 受体 α 链）和不变链 (Ii)，在 PC12 细胞中表达这些蛋白，并确定了它们的定位。一项详细的研究表明：每个区域都包含定位于内体和突触样囊泡（SLMV）的信号。使用各种突变体的详细分析表明，每个区域都包含定义不同亚细胞定位的 g-亮氨酸信号。特别是，已揭示 C 末端细胞质区域负责直接从跨高尔基体网络 (TGN) 转运至核内体/SLMV，而无需穿过细胞膜。因此，为了检查ZnT3和μ3亚基之间的直接相互作用，我们使用GST-ZnT3蛋白进行SPR分析并检测纯化的μ3A和μ3B蛋白。这些结果表明 AP-3A/B 与 ZnT3 的 C 端细胞质区域结合，可能参与从 TGN 直接转运到内体/SLMV。当我们使用类似于 ZnT3 的嵌合蛋白分析 VGAT 时，我们证实了在 N 端和 C 端侧定义细胞内定位的信号的存在。特别是，发现C末端侧存在g-亮氨酸样信号，该信号参与VGAT的内吞作用和细胞内定位。