サルES細胞から内耳有毛細胞の効率的なin vitro分化誘導法の開発

猴ES细胞内耳毛细胞高效体外分化诱导方法的开发

基本信息

批准号：
21659393
负责人：
吉川正英
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Nara Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では難聴に対する細胞移植治療を目指し、まずは多分化能を有する胚性幹細胞(ES細胞)より内耳有毛細胞へのin vitro分化誘導法の開発を目的とした。よりヒトに近い種の細胞を用いることで分化プロセスの解明を行う目的で、カニクイザルES細胞(cES)を用いたが、この場合、フィーダー細胞を必要とし、それらの細胞が分化誘導に対する何らかの影響を及ぼす可能性があるため、本年度はフィーダーフリーのカニクイザルES細胞(ff-cES細胞)を樹立し、さらに昨年度得られた知見を元に、内耳有毛細胞へのin vitro分化誘導を行った。ff-cES細胞は、ヒトES細胞用培地およびコーティング剤(リプロセル社)を用いることで馴化培養し、樹立した。この年ff-cES細胞は、内在性ALP活性の維持および、Oct-3/4、Nanog等の未分化関連遺伝子マーカーの発現が維持され、さらにSCIDマウスの皮下に移植することで、テラトーマの形成も認められたことから、多分化能を有するフィーダーフリーのcES細胞が樹立できたことが確認された。そこで、昨年度得られたデータを元に、ff-cES細胞を4日間胚様体形成させ、さらにストローマ細胞由来の培養上清を用いることで、内耳有毛細胞への分化誘導を試みた。最終的には、分化誘導約1カ月後に内耳有毛細胞マーカー(Math 1, Brn3.1, Myosin Vlla)の遺伝子発現および免疫染色によるタンパク質発現を認め、有毛細胞様細胞が分化誘導し得る条件を得ることができた。今後、さらにストローマ細胞から得られる液性因子のスクリーニングを行うことで、カニクイザルES細胞から内耳有毛細胞への分化プロセスを解明する予定である。

这项研究旨在用于听力丧失的细胞转移治疗，并首先开发了一种从多能胚胎干细胞（ES细胞）到内耳毛细胞的体外分化的方法。使用靠近人类的物种的细胞，使用了cynomolgus猴子ES细胞（CE）来阐明分化过程。在这种情况下，需要进料器细胞，这些细胞可能会对分化诱导有一定影响，因此，今年建立了无喂食器的cynomolgus猴子ES细胞（FF-CES细胞），并基于去年获得的发现，将体外分化诱导到内耳毛细胞中。使用人类ES细胞培养基和涂料剂（重新印象）进行条件培养FF-CES细胞。今年，FF-CES细胞维持其内源性ALP活性，并表达未分化的遗传标记，例如Oct-3/4和Nanog，并且还可以在SCID小鼠中植入它们，表明具有多种潜在的饲料细胞能够确定能够建立多种潜在的CES细胞，从而可以观察到TeraTomas的形成。因此，根据去年获得的数据，我们试图通过形成4天的FF-CES细胞并使用源自基质细胞的培养上清液来诱导内耳毛细胞分化。最后，观察到分化诱导后大约一个月，内耳毛细胞标记（Math 1，BRN3.1，肌球蛋白VLLA）和蛋白质表达的基因表达通过免疫染色，从而导致允许毛细胞样细胞诱导分化的条件。将来，我们计划进一步筛选从基质细胞获得的体液因子，以阐明从cynomolgus猴子ES细胞中的分化过程到内耳毛细胞。