Development of novel cochlear regenerative medicine using mRNA and siRNA-encapsulated nanocarriers

使用 mRNA 和 siRNA 封装的纳米载体开发新型耳蜗再生医学

基本信息

批准号：
22K19597
负责人：
山岨達也
金额：
$ 4.16万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

mRNAを細胞内に送達するとタンパク質が発現分泌され、細胞機能を体内で直接制御することが期待される。ただ、mRNAを安定な形で細胞内に送り込むことは困難であったのでそれを内包するナノキャリアを開発した。さらにsiRNAを内包して標的細胞で効果を得るナノキャリアも開発する。蝸牛有毛細胞は再生しないため、重度難聴の治療には有毛細胞の再生医療が必要である。本研究では支持細胞分裂から形質転換を介した有毛細胞の再生誘導、神経線維の変性予防と再生誘導を目的にターゲットとなる遺伝子のmRNAやsiRNAを内包したナノキャリアを蝸牛に投与し、広範な有毛細胞障害後の機能および組織再生に挑戦する。まずは有毛細胞をほぼすべて安定的に死滅させる手技を開発した。従来はモルモットの蝸牛有毛細胞をエクタクリン酸(50mg/kg内頚静脈に静注)とカナマイシン(400mg/kg筋注)により傷害する手法を用いてたが、この手法では内頸静脈を確保するために麻酔による切開手術が必要であり、動物が侵襲のため致死に陥ることなどのリスクを回避するため、心腔内注入の手法を開発した。障害4日後に聴覚機能を聴性脳幹反応(ABR)により調べ、すべての動物で重度難聴を呈することを確認した。現在、蝸牛上皮を採取し、有毛細胞マーカー(myosin VIIa)、幹細胞マーカー（SOX2)および核マーカー(DAPI)により組織学的に障害を解析中である。また、遺伝子発現の評価のためのmRNA定量を目的として、Cdkn1b (p27)及びAtoh1のプライマ等のqPCRの条件検討をHEI-OC1細胞株において行った。p27siRNAとAtoh1ｍRNA、BDNFｍRNAについては東京医科歯科大学と打ち合わせを行い、その作成工程について検討している。

当mRNA传递到细胞中时，蛋白质会表达和分泌，预计人体将直接调节细胞功能。但是，很难以稳定的形式将mRNA发送到细胞中，因此我们开发了一种封装它的纳米载体。此外，还开发了含有siRNA的纳米载体，并且可以在靶细胞中有效。由于耳蜗毛细胞不会再生，因此需要用于毛细胞的再生医学来治疗严重的听力损失。在这项研究中，我们管理含有mRNA和siRNA的纳米载体，靶向基因，以通过转化诱导毛细胞再生，以预防和诱导神经纤维的退化，对耳蜗，并挑战多种毛细胞后的功能和组织再生。首先，我们开发了一种稳定杀死几乎所有毛细胞的技术。以前，使用一种技术来损害豚鼠的耳蜗毛细胞（静脉内注射到50 mg/kg内颈内静脉）和卡纳米霉素（肌内注射400 mg/kg）。但是，在这项技术中，需要在麻醉下进行开放手术以确保内部颈静脉，并为了避免导致动物因侵入性而死亡的风险，我们已经开发了一种心脏内注射技术。疾病后四天通过听觉脑干反应（ABR）检查了听力功能，证实了所有动物中都存在严重的听力损失。目前正在收集人工耳蜗上皮，并使用毛细胞标记（肌球蛋白VIIA），干细胞标记（SOX2）和核标记（DAPI）对损伤进行组织学分析。此外，在HEI-OC1细胞系中检查了QPCR（P27）和ATOH1引物等QPCR（例如CDKN1B（P27）和ATOH1引物）的QPCR条件的目的。我们一直在与东京医学和牙科大学讨论p27sirna，atoh1mrna和bdnfmrna，并正在考虑生产过程。