難聴遺伝子変異マウスへのiPS細胞移植による難聴レスキュウー

将iPS细胞移植到耳聋基因突变小鼠中挽救听力损失

基本信息

批准号：
21659394
负责人：
池田勝久
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Juntendo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では難聴遺伝子変異マウス内耳へのiPS細胞の効果的な細胞導入法を開発するため以下の成果が得ている。1.遺伝子変異マウスの作製:我々は細胞移植治療の対象とする遺伝性難聴モデルマウスとして、ヒト遺伝性難聴において世界で最も高頻度に変異が検出されるConnexin26(Cx26)のコンディショナルノックアウトを新規に作成した。まず新規に作成したCx26遺伝子のfloxedマウスにP0プロモーターの制御下で内耳を含む神経系全域でCre遺伝子を発現するトランスジェニックマウスであるP0-Creマウスを交配し、floxed Cx26アレルがホモ接合体であり、Cre遺伝子が陽性となる個体(Cx26コンディショナルKO)を選抜し、同腹仔とともに移植実験に供した。2.経半規管細胞移植法の検討:まず既に移植効果の確認されている骨髄間葉系幹細胞(MSC)により検討した。半規管に小孔をあけ、2×10^5cellsを還流し、小孔の修復のためにMSCの無接着培養により作成した細胞塊(cell sphere)を小孔部に挿入することにより術後のリンパ液の漏出を抑えた。挿入された移植細胞塊は術後2週間においても半規管組織内において維持、さらには進展していることが確認されている。3.移植細胞の検出:経半規管移植後の組織を抗GFP抗体での免疫蛍光染色により移植細胞の組織進入を解析したところ、前庭線維細胞組織内、蝸牛ラセン板縁組織内に移植細胞の生着を確認した。移植後の聴力を術後8週間までモニタリングしたが、手術による聴力低下は正常動物でも難聴モデルにおいても見られなかった。4.iPS細胞の調整:マウスiPS細胞は理研バイオリソースセンターからの供与を受けSNLフィーダー細胞存在下で培養を行っている。内耳前駆細胞への分化を即し前述の方法で難聴モデル動物へ導入する予定である。

在本研究中，为了开发一种将iPS细胞导入耳聋基因突变小鼠内耳的有效方法，我们获得了以下结果。 1. 基因突变小鼠的创建：作为用于细胞移植治疗的基因突变小鼠模型小鼠，我们开发了一种新的Connexin26（Cx26）条件敲除模型，这是世界上最常检测到的人类遗传性听力损失突变。。首先，将新创建的带有 Cx26 基因的 floxed 小鼠与 P0-Cre 小鼠杂交，P0-Cre 小鼠是一种转基因小鼠，在 P0 启动子的控制下，在整个神经系统（包括内耳）和 floxed Cx26 的控制下表达 Cre 基因。选择具有阳性Cre基因（Cx26条件KO）的等位基因纯合的个体并与其同窝仔鼠一起进行移植实验。 2.半规管细胞移植方法的检查：首先，使用已被证实具有移植效果的骨髓间充质干细胞（MSC）进行检查。在半规管上打一个小孔，灌注2×10^5个细胞，将MSC非贴壁培养产生的细胞球插入小孔中，修复小孔，从而清除术后淋巴液。泄漏得到抑制。已证实，即使在手术后两周，插入的移植细胞团仍能在半规管组织内维持甚至进展。 3.移植细胞的检测：经半规管移植后，用抗GFP抗体进行免疫荧光染色分析移植细胞的组织侵袭情况，发现移植细胞在前庭纤维细胞组织和耳蜗螺旋板组织内生长。我检查了到达情况。术后对植入后听力进行长达 8 周的监测，在正常动物或听力损失模型中均未观察到因手术引起的听力损失。 4. iPS细胞的制备：小鼠iPS细胞由RIKEN BioResource Center提供并在SNL饲养细胞存在下培养。我们计划分化为内耳祖细胞，并使用上述方法将其引入听力损失模型动物中。