Gjb2のコンディショナル・ノックアウト・マウスの遺伝子導入による難聴レスキュー

Gjb2条件性敲除小鼠基因转移挽救听力损失

基本信息

批准号：
15659402
负责人：
池田勝久
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Juntendo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15659402/
关键词：
GJB2遺伝子先天性難聴聴性脳幹反応動物モデルコルチ器

项目摘要

先天性難聴の原因として、GJB2遺伝子変異が重要であることはよく知られている。ヒトでの解析には限界があるので、動物モデルでの解析が検討されている。Cre recombinase存在下でgjb2遺伝子翻訳領域が切り取られるようなコンストラクトを作成し、ES細胞に相同組換えにより導入した。ネオマイシンによる選別を行いサザンブロット法により組替え体を同定した。ES細胞をB6マウスの胚盤胞へ注入してキメラマウスを作製した。続いてB6マウスと戻し交配を行いF1マウスを得た。Cre recombinaseを持つトランスジェニックマウスと交配させ、遺伝子欠失マウスを同定し解析に供した。聴性脳幹反応で聴力閾値を測定し、内耳を採取、パラフィンまたはエポンに包埋した。パラフィンに包埋したサンプルをヘマトキシリン・エオジン(H & E)染色、免疫組織染色で解析した。(Gjb2欠失マウスでは最大100dBのクリック音刺激でも脳幹反応を得ることができなかった。一方、野生型ではI-V波の明瞭な聴性脳幹反応を認め、閾値は30dB以下であった。欠失マウスではspiral limbusの線維細胞の減少が認められた。またコルチ器の構造がやや虚脱している所見が得られ、優性的阻害効果のあるgjb2変異マウスに類似した。血管条、ラセン靱帯の線維細胞、ラセン神経節細胞、ライスネル膜、蓋膜などは両者に明らかな違いは認めなかった。聴性脳幹反応による聴力検査では変異体では極めて高度な難聴像を示した。今回作製したマウスはヒトのGJB2の異常による言語習得前の高度難聴と極めて類似した表現型を示すことが判明し、ヒト(GJB2遺伝子変異による難聴のマウスモデルとなることが示唆された。

众所周知，GJB2 基因突变是先天性听力损失的重要原因。由于对人类的分析存在局限性，因此正在考虑对动物模型进行分析。创建了在 Cre 重组酶存在下切除 gjb2 基因翻译区的构建体，并通过同源重组将其引入 ES 细胞中。用新霉素选择后通过Southern印迹鉴定重组体。通过将 ES 细胞注射到 B6 小鼠的囊胚中产生嵌合小鼠。随后与B6小鼠回交，获得F1小鼠。他们与携带 Cre 重组酶的转基因小鼠杂交，以鉴定基因缺陷小鼠并对其进行分析。使用听觉脑干反应测量听力阈值，收获内耳并包埋在石蜡或 Epon 中。使用苏木精和伊红 (H&E) 染色和免疫组织学染色对石蜡中包埋的样品进行分析。（在Gjb2缺失小鼠中，即使用高达100 dB的点击声刺激也无法获得脑干反应。另一方面，在野生型中，观察到清晰的I-V波听觉脑干反应，阈值低于30 dB。删除小鼠如此螺旋还观察到角膜缘的纤维细胞减少，发现柯蒂氏器的结构轻微塌陷，与血管纹类似，螺旋韧带的纤维细胞与螺旋之间没有观察到明显的差异。神经节细胞、赖斯纳膜和盖膜。使用听觉脑干反应进行的听力测试显示，突变体中的听力损失极其严重。结果发现，这次创建的小鼠表现出与人类语言习得前由于GJB2异常而导致的严重听力损失极其相似的表型。这可能作为 GJB2 基因突变引起的听力损失的小鼠模型。