共焦点レーザ顕微鏡による蝸牛のイオン輸送の細胞分子生理学的研究

使用共焦激光显微镜进行耳蜗离子传输的细胞和分子生理学研究

基本信息

批准号：
08457447
负责人：
池田勝久
金额：
$ 3.71万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08457447/
关键词：
内耳血管条チャネル輸送体共焦点レーザー顕微鏡 DNA

项目摘要

内耳の音受容には特異な電気的環境(+80〜+90正電位)とイオン環境(高Na^+、低Cl^-)を維持している血管条細胞と受容器細胞である有毛細胞のが主役を演じている。有毛細胞にはK^+、Ca^<2+>チャンネル、Na-H交換輸送、Cl-HCO_3交換輸送、血管輸送、血管条の辺縁細胞にはCl^-チャネル、K^+チャネル、非選択性陽イオンチャネル、P2リセプター、Naポンプが存在し重要な働きをしている。これらの機能蛋白の細胞、膜レベルでの細胞生物学的情報伝達系、相互作用、(クロストーク)、分子生物学的解析などの本質的研究を行ない、内耳の音受容の巧妙な機構を説明する各種イオン輸送蛋白の解明を行なった。1)チャンネル蛋白によるイオン輸送摘出した外有毛細胞と血管条に電位感受性色素や細胞内Ca^<2+>色素を負荷し、脱分極刺激による電位変化または細胞内Ca^<2+>濃度変化をリアルタイム共焦点レーザー顕微鏡を用いた顕微画像解析装置(現有設備)により設定し、Caチャネルやアゴニストの受容体の局在を解明された。2)担体蛋白によるイオン輸送摘出した外有毛細胞と血管条に電細胞内Ca^<2+>、Na^+、pH色素を負荷し細胞外のイオン組成を変えることによって種々の担体蛋白系(Naポンプ、Na-Ca交換輸送、Na-H交換輸送、Cl-HCO_3交換輸送Na-K-Cl共有送)を活性化して、リアルタイム共焦点レーザー顕微鏡を用いた顕微画像解析装置により測定し担体蛋白の局在を解明された。イオン輸送の局在とmRNAの発現機能の発現が同定されたチャンネル蛋白や担体蛋白の特異的構造ペプチド部位を合成する。合成ペプチドをウサギに免疫し抗血清を得て、蝸牛組織において免疫組織学的にその局在を調べた。イオン輸送をコードするcDNAをプローブとしてコルチ器と外側壁それぞれより採集したmRNAよりnorthern blot法でイオン輸送蛋白のmRNAを同定し、定量化した。さらに、そのcDNAプローブを作製して、蝸牛においてins situ hybridizationを行ない、発現細胞を同定した。

对于内耳的声音接收，纹状体血管细胞和毛感受器细胞维持着独特的电环境（+80至+90正电位）和离子环境（高Na^+，低Cl^-）细胞起主导作用。毛细胞有K^+、Ca^2+通道、Na-H交换转运、Cl-HCO_3交换转运、血管纹边缘细胞有Cl^-通道、K^+通道、非选择性阳离子；通道、P2 受体和 Na 泵存在并发挥着重要作用。我们将对细胞生物信息传输系统、相互作用（串扰）以及这些功能蛋白在细胞和膜水平上的分子生物学分析进行必要的研究，并解释内耳声音接收的巧妙机制。离子转运蛋白。 1)通道蛋白的离子传输将电压敏感染料和细胞内Ca^2+染料加载到切除的外毛细胞和血管纹中，并测量由于去极化刺激而引起的电位变化或细胞内Ca^2+浓度。使用实时共焦激光显微镜的显微图像分析装置（目前可用）确定变化，并阐明 Ca 通道和激动剂受体的定位。 2)使用载体蛋白的离子运输通过将细胞内Ca 2+ 、Na 2+ 和pH染料加载到切除的外毛细胞和血管纹上并改变细胞外离子组成，可以产生各种载体蛋白系统（Na泵。、Na-Ca交换传输、Na-H交换传输、Cl-HCO_3交换传输、Na-K-Cl共传输）通过使用实时共焦激光显微镜的显微图像分析装置被激活和测量的定位。蛋白质得到澄清。合成通道蛋白和载体蛋白的特定结构肽位点，其离子转运和 mRNA 功能表达的定位已被确定。用合成肽免疫家兔以获得抗血清，并通过免疫组织学研究其在耳蜗组织中的定位。我们使用编码离子转运的cDNA作为探针，使用Northern印迹法从从柯蒂氏器和侧壁收集的mRNA中鉴定并定量了离子转运蛋白的mRNA。此外，我们创建了 cDNA 探针并在耳蜗中进行原位杂交以鉴定表达细胞。