血友病A患者からモノクローナルインヒビターと抗イディオタイプ抗体の作製と抗原解析

A型血友病患者单克隆抑制剂和抗独特型抗体的制备和抗原分析

基本信息

批准号：
21659242
负责人：
山本正雅
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Ohu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

【目的】ヒト末梢単核球をSPYMEG細胞とPEG法で融合しヒト抗体産生ハイブリドーマを作製する方法によりヒトインフルエンザウイルスに対する抗体作製が可能であることを示してきた(BBRC387(2009)180-185)。本法を用いて、血友病A患者に発生したインヒビター抗体の作製を目的とした。【結果】細胞融合には化学的なPEG法を用いた。コロニー形成率は10～30%と低かった。ハイブリドーマ培養上清の抗体をELISA法によりスクリーニングしたがインヒビター陽性ウェルは確認できなかった。感染症患者から抗インフルエンザウイルス抗体を作製したようにはインヒビター抗体が得られなかったことから、改善が必要と考え、(1)血中抗体の力価の差、(2)融合効率の改善、(3)抗体産生細胞の濃縮に関し検討した。(1)は高力価の患者を利用することで対応可能とした。(2)の対応は、電気的融合法を検討した。電気的手法は細胞への傷害が少なく、PEG法より高効率で抗体作製ができるとされる。SPYMEGでは電圧を400V以上にすることにより融合効率をPEGと同程度(100%融合率)に高めることに成功した。しかし本条件下では抗体産生率がPEG法に比べ約1/2と著しく低くPEG法を踏襲した。次に(3)であるが、血友病A患者からの融合成績では、融合初期に陽性クローンが確認できたが、培養途中で産生能を失うことが主な原因であった。そこで、抗原をコーティングした磁気ビーズを用い、抗体産生細胞を選択する方法を検討し、細胞を特異的に好成績であった。【考察】電気融合法はPEG法を超えなかったので、PEG法にて血友病A患者からのインヒビターの作製を試みたが、最終的に陽性クローンは得られなかった。今後、さらなる改善策として、磁気ビーズによる細胞の濃縮と、ウアバインなどによる遺伝子の脱落を抑えるなどの処理を行い、抗体産生を安定化させ、高力価のインヒビター陽性患者からの末梢単核球を調製し例数を多く試みる必要がある。

[目的] 我们已经证明，通过使用PEG方法将人外周单核细胞与SPYMEG细胞融合以产生产生人抗体的杂交瘤，可以产生针对人流感病毒的抗体(BBRC387(2009)180-185)。使用这种方法，我们的目标是产生在甲型血友病患者中开发的抑制剂抗体。 [结果]采用化学PEG法进行细胞融合。集落形成率低至10-30%。通过ELISA筛选杂交瘤培养物上清液中的抗体，但未确认抑制剂阳性孔。由于抑制剂抗体的获得方式与从传染病患者体内产生抗流感病毒抗体的方式不同，因此我们认为有必要进行改进（3）我们研究了抗体产生细胞的富集。 (1)可采用滴度高的患者进行处理。为了解决（2），我们考虑了电融合方法。电法对细胞的损伤较小，据说能够比 PEG 法更高效地生产抗体。在SPYMEG中，我们通过将电压提高到400V或更高，成功地将融合效率提高到与PEG相同的水平（100%融合率）。然而，在这些条件下，抗体产生率明显低于PEG方法，约为PEG方法的一半。接下来，关于（3），在A型血友病患者的融合结果中，在融合早期就确认了阳性克隆，但主要原因是它们在培养过程中失去了生产能力。因此，我们研究了一种使用抗原包被的磁珠来选择产生抗体的细胞的方法，并在细胞特异性选择中发现了良好的结果。 [讨论]由于电融合法没有超越PEG法，我们尝试用PEG法从A型血友病患者身上生产抑制剂，但最终没有获得阳性克隆。今后，作为进一步的改进措施，我们将进行磁珠浓缩细胞、哇巴因抑制基因脱落等治疗，以稳定抗体产生并收集高效价抑制剂阳性患者的外周单核细胞。需要准备和尝试很多例子。