血小板コラゲン受容体GPIVとGPVIの単クローン抗体の作成と受容機序の解明

血小板胶原蛋白受体GPIV和GPVI单克隆抗体的制备及受体机制的阐明

基本信息

批准号：
05670939
负责人：
山本正雅
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05670939/
关键词：
GPIV GPVI コラゲン受容体 GPIb P-selectin モノクローナル抗体血小板無力症血小板凝集

项目摘要

血小板のコラゲン受容体であると考えられているGPIVとGPVIに対するモノクローナル抗体の作成を目的に本研究を行った。洗浄血小板を抗原にし免疫し、コラゲン凝集を抑制するモノクローナル抗体をスクリーニングで選択して作成する方法では、抗原性の強いGPIIb/IIIa複合体抗体が主に作成されるため、比較的抗原量が低いGPIV(10,000-20,000個/血小板)に対する抗体は極めて作成が難しかった。そこで、我々は、GPIIb/IIIaが完全に欠損しているGlanzmannの血小板無力症のタイプIの血小板を抗原として免疫しモノクロナール抗体の作成を行った。培養上清を洗浄血小板に加え、コラゲン凝集の抑制を観察した。同時に、GPIV欠損(Nak^a陰性)あるいはGPVI欠損血小板への抗体の結合性の違いを正常血小板とELISAで比較し、抗体の産生の指標とした。血小板凝集抑制を指標とするスクリーニングで抑制が認められたクローンがGS64、GS70、GS312が作成された。GS64はコラゲン凝集の抑制が軽度、あるいは認められない程度であるが、GS70は20-30μg/mlで明らかなコラゲン凝集の抑制が認められた。この両抗体はGPIb関連抗原を認識しているが、GS312はP-selectin(GMP140)を認識していることが明らかとなった。またGPIV欠損血小板への結合性が低下していたモノクローナル抗体GS95は、ヨード標識したこの抗体が交叉免疫電気泳動でGPIVの沈降線に取り込まれることから、GPIVを認識したモノクローナル抗体であることが明らかとなった。本抗体はHigh ResponderのGPIV陽性の血小板を凝集させるが、GPIV陰性の血小板の凝集は惹起しなかった。コラゲン凝集への影響は認められなかった。本研究ではGPVIを認識するモノクローナル抗体は得られなかった。これらの結果から、血小板にはGPIVやGPVI以外に、GPIb関連抗原やP-selectinなどの糖蛋白がコラゲン凝集の機序に間接的に関係していることが明らかになり、血小板のコラゲン凝集の機序の複雑さが示された。

这项研究的目的是创建针对 GPIV 和 GPVI 的单克隆抗体，它们被认为是血小板的胶原蛋白受体。在使用洗涤的血小板作为抗原进行免疫并筛选选择抑制胶原聚集的单克隆抗体的方法中，主要产生具有强抗原性的GPIIb/IIIa复合抗体，因此抗原的量相对较低，因此产生抗体是极其困难的。对抗 GPIV（10,000-20,000 血小板/血小板）。因此，我们通过对患有格兰兹曼血栓无力症的 I 型血小板（GPIIb/IIIa 完全缺乏）的患者进行免疫来制备单克隆抗体。将培养物上清液添加到洗涤的血小板中，观察到胶原聚集的抑制。同时，通过ELISA比较GPIV缺陷(Nakα阴性)或GPVI缺陷血小板与正常血小板的抗体结合差异，作为抗体产生的指标。创建了克隆 GS64、GS70 和 GS312，在以抑制血小板聚集为指标的筛选中发现它们可以抑制血小板聚集。 GS64 显示出对胶原蛋白聚集的轻微抑制或没有抑制作用，但 GS70 在 20-30 μg/ml 浓度下显示出对胶原蛋白聚集的明显抑制。两种抗体均识别 GPIb 相关抗原，但研究表明 GS312 识别 P-选择素 (GMP140)。此外，与GPIV缺陷血小板的结合减少的单克隆抗体GS95，由于在交叉免疫电泳中将该碘标记抗体掺入到GPIV沉降线中，因此被明确地识别为识别GPIV的单克隆抗体。该抗体聚集高反应者的 GPIV 阳性血小板，但不会引起 GPIV 阴性血小板聚集。没有观察到对胶原聚集的影响。本研究未获得识别 GPVI 的单克隆抗体。这些结果表明，在血小板中，除了GPIV和GPVI之外，GPIb相关抗原和P-选择素等糖蛋白也间接参与胶原聚集机制，证明了其机制的复杂性。