新しい融合パートナーSPYMEGを用いるヒト抗血小板抗体産生ハイブドーマの作製

使用新的融合伙伴 SPYMEG 生成产生人抗血小板抗体的杂交瘤

基本信息

批准号：
17659297
负责人：
山本正雅
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Ohu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

フュージョンパートナー細胞SPYMEGを用いてヒトのモノクローナル抗体が作製できるか否かを検討した。健常人の末梢血よりリンパ球を得てSPYMEGとPEG法を用いて融合させ、HAT存在下にてハイブリドーマ細胞を培養した。融合細胞を768ウエルに播種したところ、コロニー形成率は平均28%(2回の融合)であった。IgG産生能をサンドイッチELISAにて測定した結果、コロニーが形成されたウエル中27%で陽性であった。これは既報のパートナー細胞Karpasを用いた成績に極めて近い値であった。ヒトのIgGを産生している細胞を限界希釈し単クローンにし、IgGを精製したところ、H-鎖、L-鎖ともに発現しており、完全なIgGが合成されていることが分った。抗体産生能はハイブリドーマに依存するがよく産生するクローンで2〜10μg/ml程度であった。ハイブリドーマはセルバンカーを用いて1ヶ月凍結保存し、その後再び培養を再開しても抗体産生能は凍結前に比べ変化はなかった。この結果から、かなり安定したヒトのモノクローナル抗体が作製できることが明らかになった。そこで、ヒトの特異的モノクローナル抗体を作製するために、ヒトに投与できる抗原としてインフルエンザワクチンを用いた。インフルエンザワクチン投与した場合、投与後1ヶ月以内に末梢血リンパ球を得てSPYMEGと融合させ、HAT存在下にてハイブリドーマ細胞を培養した。またインフルエンザに自然感染した健常人についても検討した。融合細胞を384ウエルに播種し、インフルエンザワクチン抗原AとBの混合液ををELISAプレートにコートし、スクリーニングを行なった。その結果、自然感染の健常人からのリンパ球を用いたときインフルエンザ抗原に陽性に反応するモノクローナル抗体が14クローンが陽性であり、最終的に2クローンが得られた。インフルエンザワクチンを投与したとき、121クローンが陽性であった。このうち最終的に12クローンが得られた。同手法を用いて、血小板のGPIIb/IIIa複合体に対する抗体を産生している自己免疫疾患患者から抗体の作製を行なった。その結果、2クローンが健常人の血小板に反応しIIb/IIIaを免疫沈降してくることがわかった。これらの結果から、SPYMEGはヒトのモノクローナル抗体の作製が可能でり、臨床と基礎医学研究に役立つと考えられた。

我们检查了使用融合伴侣细胞spymeg可以产生人类单克隆抗体。淋巴细胞是从健康人的外周血中获得的，并使用Spymeg和PEG方法融合，并以HAT培养杂交瘤细胞。当融合细胞在768腔中播种时，菌落的形成速率为28％（两个融合）。由于用三明治ELISA测量IgG产生的结果，菌落形成的井中有27％为阳性。使用先前报道的伴侣细胞karpas，这非常接近结果。当产生人类IgG的细胞被稀释并精炼IgG时，它已经在H链和L链中表达，并发现完整的IgG已合成。抗体的生产能力取决于杂交，但大约是通常产生的克隆的2至10μg/ml。杂交瘤使用自我灌注者保存了一个月，在再次静止培养后，与冷冻之前相比，抗生素产量没有改变。该结果表明，可以产生一种非常稳定的人类单克隆抗体。因此，流感疫苗被用作可用于人类产生人类特异性单克隆抗体的抗原。在流感疫苗的情况下，给药后一个月内通过外周血血液淋巴细胞获得外周血淋巴细胞，并用HAT培养杂交瘤细胞。他还检查了自然感染流感的健康人。将融合细胞播种在384颗Wels中，并将流感疫苗A和B的混合物涂在ELISA板上，并进行筛选。结果，当使用了自然感染的淋巴细胞时，单克隆抗体对流感抗原的阳性抗体是阳性的，最终获得了两个克隆。当施用流感疫苗时，121个克隆为阳性。其中，最终获得了12个克隆。使用相同的方法，由自身免疫性疾病患者产生抗体，该抗体产生了血小板GPIIB/IIIA复合物的抗体。结果，发现两个克隆对健康人的血小板有反应，并对IIB/IIIA的免疫力做出了反应。这些结果表明，Spymeg能够产生人类的单克隆抗体，并且对临床和基础医学研究非常有用。