G蛋白質の迅速な活性化手法の開発

G蛋白快速激活方法的开发

基本信息

批准号：
21657035
负责人：
前濱朝彦
金额：
$ 2.05万
依托单位：
National Institute of Infectious Diseases
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21657035/
关键词：
シグナル伝達蛋白質発現制御

项目摘要

Gタンパク質は多彩な細胞内シグナルを制御するスイッチ分子であり、結合するグアニンヌクレオチド(GDPまたはGTP)によってその機能が制御されている。一般的にGタンパク質はGTPが結合することによって活性化型となり、下流エフェクター分子と相互作用してシグナルを伝達する。我々は前年度の研究において、NWASP-CRIB(Cdc42結合ドメイン)の両端にFKBP12およびmTOR-FRBを付加した分子が細胞内で活性化型Cdc42と結合すること、またその結合がラパマイシンの添加によって制御できることを見いだした。本年度の研究では、まずCdc42およびサプレッサー分子の精製リコンビナントタンパク質を用いて、両者間の結合をin vitroで詳細に解析する実験系を構築した。そしてサプレッサーの各ドメイン(NWASP-CRIB、FKBP12、mTOR-FRB)間のリンカー配列の至適化(長さ、フレキシビリティー)を行い、より効率的にCdc42に結合するサプレッサー分子を開発した。さらに、Cdc42の活性化によって惹起される細胞レベルでの表現型として、Erk1/2のリン酸化(MCF-7細胞)、Aktのリン酸化(MCF-7細胞)、フィロポディア形成(NIH3T3細胞)などを用い、サプレッサーの作用(ラパマイシン応答性のCdc42下流シグナルの活性化)を評価するモデル系を構築した。また、Cdc42以外の低分子量Gタンパク質に関しても、RalAに対するサプレッサー分子(Sec5-RBDの両端にFKBP12およびmTOR-FRBを付加した分子)を開発し、RalAの活性化によって引き起こされる4E-BP1のリン酸化(PC-3細胞およびMCF-7細胞)を指標として、その作用を評価するモデル系を構築した。

G蛋白是控制各种细胞内信号的开关分子，并且该功能由结合鸟嘌呤nuuleotide（GDP或GTP）控制。通常，G蛋白通过GTP的组合激活G蛋白，并与下游效应分子相互作用以传输信号。在上一年的研究中，我们控制了将FKBP12和MTOR-FRB添加到NWASP-CRIBER（CDC42结合域）的两端，并在细胞中活化的CDC42，并且键是通过添加腹股菌来控制的。。在今年的研究中，我们首先建立了一个实验系统，该系统使用CDC42和分子分子的精制重新覆盖蛋白在体外详细分析了两者之间的键。进行了接头序列（长度，柔韧性）（长度，柔韧性）（nwasp-crib，fkbp12，mtor-frb），并开发了更有效地与cdc42结合的供应分子。此外，作为由CDC42，ERK1/2磷酸化（MCF-7细胞），AKT磷酸化（MCF-7细胞）（MCF-7细胞），天嗜性形成（NIH3T3细胞）的激活引起的细胞水平上的表达类型。已经构建了系统来评估供应商的作用（腹腔霉素反应的CDC42下游信号的激活）。另外，对于Cdc42以外的低分子量G蛋白，开发了RALA的分子（添加到SEC5-RBD的两端的RALA分子），由Rala激活引起的4e-BP1磷酸化评估其作用是用（PC-3细胞和MCF-7细胞）作为指标构建的。