FACSを利用した新規なタンパク質機能モチーフ探索法の開発

使用 FACS 开发新型蛋白质功能基序搜索方法

基本信息

批准号：
19657044
负责人：
前濱朝彦
金额：
$ 2.18万
依托单位：
National Institute of Infectious Diseases
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19657044/
关键词：
タンパク質分解ランダム変異

项目摘要

本研究では、ランダム変異導入とFACSソーティングを組み合わせて蛋白質の機能モチーフをスクリーニングする手法の開発を目的とし、癌抑制因子PICT-1を題材として、その細胞内動態(ストレス依存性の分解および核小体局在)を制御する機能モチーフの同定およびその生理的意義の解明を試みた。まずPICT-1の核小体移行を制御する機能モチーフのスクリーニングにおいては、PICT-1蛋白質上の複数部位が細胞内局在決定に関与する可能性を見いだした。さらにPICT-1のN末端側およびC末端側の双方共に核小体への局在を示すことが明らかとなり、それぞれの領域における核小体移行モチーフの同定を試みたが、本法で用いたRUBY法プローブであるPICT-1BP1が、分割したPICT-1とは結合しないことが明らかとなり、異なるプローブを用いた新規スクリーニング法が必要となった。続いて、PICT-1の分解を制御する機能モチーフのスクリーニングを行ったが、本スクリーニングにおいても少なくとも三カ所以上の複数部位が分解制御に関与する可能性を見いだした。またPICT-1をN末端側とC末端側の二つに分割した場合、どちらの領域もストレス応答性の分解を受けることが明らかとなった。さらにPICT-1分解がアポトーシス誘導剤を中心とした様々なストレス誘導剤によって起こること、またこの分解がUBE1非依存性であることを見いだした。プロテアーゼ阻害剤を用いた解析からは、この分解がMG132感受性かつカテプシンB/D非依存性であることが明らかとなった。以上の結果から、PICT-1は強いストレスによって構造的な制御を失ったプロテアソーム酵素群によって分解されている可能性が示された。

在这项研究中，通过结合随机突变引入和FACS分类来开发一种筛选蛋白质功能基序的方法，并基于癌症抑制因子Pict-1。阐明其生理意义。首先，在筛选控制PICT-1核转变的函数基序时，发现PICT-1蛋白上的多个部分可能与内部内部测定有关。此外，很明显，PICT-1的N末端和C末端都显示了核的定位，我们试图识别每个区域中的核过渡基序，但在本法中使用了它据表明，Ruby方法探针（探针）未与Split Pict-1结合，并且需要使用不同的探针进行新的筛选方法。随后，筛选了控制PICT-1分解的功能基序，发现该筛选的至少三个或更多部分可能与分解控制有关。同样，当将PITS-1分为两个部分，即N端侧和C端侧时，据揭示了两个区域在压力反应中均已分解。他还发现，PICT-1是由各种应力诱导剂（主要是细胞凋亡）引起的，并且这种分解是UBE1非依赖性的。使用蛋白酶抑制剂的分析表明，这种分解是MG132敏感性和无依赖性组织蛋白酶B/D。以上结果表明，PITS-1是由由于强烈压力而失去结构控制的原生酶分解的。