PNAを用いた腎尿細管培養細胞内mRNA発現調節・解析システムの開発

利用 PNA 开发肾小管培养细胞 mRNA 表达调控和分析系统

基本信息

批准号：
13877163
负责人：
根東義明
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13877163/
关键词：
PNA FITC 尿細管イオン輸送 mRNA

项目摘要

まず、本研究で用いるPNAの合成に関して、固相合成を用いるPNA合成の自動合成法を検討した。本研究の分担研究者の根東はヘテロ環化合物を中心とした生理活性小分子の固相自動合成について、ACT496という合成機を用いて検討しており、技術的には対応可能であったが、まだ細部においては最適化が必要である。固相合成については、修飾核酸に関連してデアザプリンのモデルとしてインドール誘導体の合成研究も行った。また、合成機を用いずにより簡便に合成するためにマルチピン法を用いるPNA合成法を確定した。つぎに、蛍光プローブであるFITCを分子内に導入して、その細胞内への取り込みを正確にモニターする方法については、PNAの細胞膜の透過性を評価するために有用であることが明らかとなった。今回の研究では、腎尿細管細胞を直接用いることは結果的にできなかったが、細胞株を利用し、検討を加えた。HEK細胞(ヒト胎児腎細胞由来細胞株)に修飾核酸キュウーオシンの合成酵素HuTGTをコードする遺伝子のアンチセンス(FITC-O-ATGCCGCTCTACTCCG-O-Lys)およびセンス(FITC-O-TCCCCATTTTACAGTA-O-Lys)の細胞内への導入を検討し、蛍光顕微鏡下でFITCの蛍光をもとに透過性の評価と生理機能解析を行なっている。いずれも細胞膜を透過しにくい傾向が見られたため、細胞内への核酸導入試薬であるFuGENE6とともに処理し改善が見られた。さらに標的タンパクの発現抑制およびPNAの細胞毒性の評価を行なっている。細胞株の種類によってPNAの透過性が異なることも明らかとなった。

首先，关于本研究中使用的 PNA 的合成，我们研究了使用固相合成的 PNA 自动合成方法。本研究的共同研究员Neto一直在研究使用名为ACT496的合成器自动固相合成生理活性小分子，主要是杂环化合物，技术上是可行的，但仍需要细节优化。。关于固相合成，我们还对吲哚衍生物的合成进行了研究，作为与修饰核酸相关的脱氮嘌呤的模型。此外，我们还建立了一种使用多针法的 PNA 合成方法，以便在不使用合成器的情况下更容易合成。接下来，已经清楚的是，将荧光探针 FITC 引入分子并准确监测其进入细胞的摄取的方法对于评估 PNA Ta 的细胞膜渗透性是有用的。尽管在本研究中不可能直接使用肾小管细胞，但使用细胞系进行进一步研究。 HEK细胞（人胚肾细胞来源的细胞系）中编码修饰核酸九红蛋白合酶HuTGT的基因的反义（FITC-O-ATGCCGCTCTACTCCG-O-Lys）和正义（FITC-O-TCCCCATTTTACAGTA-O-Lys） ) 我们正在研究将FITC引入细胞中，并根据荧光显微镜下FITC的荧光来评估其渗透性并分析其生理功能。两者都难以渗透细胞膜，因此用FuGENE6（一种将核酸引入细胞的试剂）进行处理后，情况有所改善。此外，我们正在评估 PNA 对靶蛋白表达的抑制和细胞毒性。研究还表明，PNA 的渗透性因细胞系类型而异。