尿中近位尿細管刷子緑膜小胞を用いたイオン輸送解析系の確立

尿近端肾小管刷绿膜囊泡离子转运分析系统的建立

基本信息

批准号：
10877163
负责人：
根東義明
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10877163/
关键词：
腎尿細管細胞膜小胞体尿中落下物質

项目摘要

これまで、尿中に落下した腎尿細管細胞を培養系に移し、培養された各種の細胞系を利用して細胞内での遺伝子メッセージの発現や、たんぱく質の発現などを検討してきた。今回は、この仕事の上に立ち、さらに尿中に多数浮遊している事が推測されている破砕細胞膜片の小胞体構造が、研究対象となり得るかどうかに関しての検討を進めた。まず、正常ヒト尿を通常の方法で採取し、それらを摂氏4度にて、通常遠心機を用いて2000回転で15分遠心し、その上清を分離後、超遠心10万gにて30分施行した。その上清は破棄し、残ったペレットをホモジナイザーを用いて粉砕し、アイソレーションバッファーとしてD-mannnitol、EGTA、Trisバッファーph7.4に再度懸濁し、Mgを用いて細胞膜分画だけを再度同様の超遠心にて沈殿させた。当初、文献(BBA647:169-176,1981とAm J Physiol F61-68,1996)に記載された方法を用いて、通常の組織片からの小胞の分離を想定し、初期遠心後の上清をポリトロンにより破砕し、細胞膜成分の中でも、サイズの大きい分画の処理を進めてみたが、残念ながら超遠心後の膜成分の回収が著しく悪く、最終的なMg沈澱処理後の小胞体の回収はほとんどゼロの状況で、そのままでは研究対象として扱えない事が明らかとなった。このため、方法論を再検討した結果、上述のように細胞膜のポリトロンによる破砕を省略し、生成を進めた結果、最終産物に細胞膜成分と思われる小胞体構造を得る事が出来た。さらにこの方法を簡略化し、小胞体の回収率を上げるために、当初の採取尿に直接Mgを加える手法を導入したところ、回収率は、最高となった。しかしながら、実際に回収された小胞体ペレットは、全尿100mlから、蛋白成分量にしても1mgにはほとんど到達せず、残念ながら今回の検討結果からは、高度に感受性のある抗体などで、存在する蛋白を同定する場合には利用可能と考えられるものの、腎組織より直接精製した小胞体で行われる膜輸送機能の検討に供するためには、大量の採尿が必要と考えられた。今後、微小サンプルでの輸送機能検討方法の確立が前提と考えられる。

到目前为止，已经将落入尿液中的肾小管细胞转移到培养系统中，并使用各种类型的培养细胞系来检查细胞内遗传信息的表达和蛋白质表达。这次，我们在这项工作的基础上，进一步研究了推测在尿液中大量漂浮的细胞膜碎片的内质网结构是否可以作为研究对象。首先，按照常规方式收集正常人尿液，使用常规离心机在4摄氏度、2000rpm下离心15分钟，分离上清液后，在100,000g下实施超速离心30分钟。弃去上清液，使用匀浆器粉碎剩余的沉淀，重悬于D-甘露醇、EGTA和作为分离缓冲液的Tris缓冲液中，并使用Mg2+超速离心来沉淀细胞膜级分。最初发表于文献（BBA647:169-176, 1981 和 Am J Physiol使用F61-68，1996中描述的方法，使用polytron破坏初始离心后的上清液，假设囊泡与正常组织碎片分离，我们尝试处理图像，但不幸的是，膜成分的恢复。超速离心效果极差，最终镁沉淀过程后内质网的回收率几乎为零，因此我们无法将其作为研究对象。因此，重新考虑方法论后，我们省略了如上所述用polytron破坏细胞膜并继续进行生产，结果获得了被认为是细胞的内质网结构。最终产品中的膜组件。此外，为了简化该方法并提高内质网的回收率，我们引入了在最初收集的尿液中直接添加Mg的方法，回收率最高。然而，实际收集的内质网颗粒从100毫升全尿中仅含1毫克蛋白质，不幸的是，从这项研究的结果来看，存在高度敏感的抗体和其他物质，但为了研究膜转运功能。由于直接从肾组织中纯化在内质网中进行，因此需要收集大量尿液。未来，有必要建立一种利用微小样本研究传输功能的方法。