酢酸菌呼吸鎖の新規末端オキシダーゼ(CIO)の解析とそのエネルギー代謝工学的応用

醋酸菌呼吸链中一种新型末端氧化酶(CIO)的分析及其在能量代谢工程中的应用

基本信息

批准号：
20658020
负责人：
松下一信
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Yamaguchi University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

酢酸菌は糖やアルコールを糖酸・有機酸に急速に酸化変換して培地中に高濃度蓄積する。「酸化発酵」と呼ばれるこの反応は細胞膜表層に結合した酸化還元酵素とそれにリンクした呼吸鎖末端オキシダーゼによって行われる特徴的な酸化反応系である。この「酸化発酵」呼吸鎖の末端には,チトクロムbo_3オキシダーゼとシアン非感受性オキシダーゼ(CIO)の2つの末端オキシダーゼが存在し,それらが複数の初発脱水素酵素と複雑に関連して機能している。本研究では,CIOの精製とその機能解析,およびケトグルコン酸発酵に関与するグリセロール脱水素酵素(GLDH)とグルコン酸脱水素酵素(GADH)と両末端オキシダーゼとの相互作用を解析することで,「酸化発酵」の機能解析も検討し、以下にまとめるような成果を得た。1) CIO過剰発現株とCIO欠損株の細胞膜のスペクトル分析,EPR分析,さらにヘム分子のHPLC-マス分析の比較解析を行うことによって,CIO分子には3種のヘム分子(b558,b595,d)が存在することが明らかになった。2) CIO過剰発現株の細胞膜からシアン耐性ユビキノール酸化活性をドデシルマルトシド(DM)で可溶化し,DEAE-ToyopearlおよびHydroxyapatiteを用いて、bo_3オキシダーゼとCIOを分離精製した。この精製CIO標品はSDS-PAGEで,53kdのブロードなバンドと33kdのバンドのメインバンドを示し,ヘムd由来の627nm付近のピークを示した。3) ケトグルコン酸発酵において,CIO欠損株では5ケトグルコン酸の生産性が向上し,CIO過剰発現株で2-ケトグルコン酸の生産が増加することが示唆され,2つの初発脱水素酵素,GLDHとGADH,が関与するグルコン酸酸化反応のシアン(アジド)耐性能などの比較から,それぞれbo_3オキシダーゼとCIOにより強くリンクして機能していることが示唆された。

乙酸细菌迅速将糖和醇转化为糖和有机酸，并在培养基中积聚高浓度。这种称为“氧化发酵”的反应是由氧化剂氧化反应系统由氧化反应系统通过与细胞膜表面结合的氧化还原酶和呼吸链末端氧化酶连接的。在这种“氧化发酵”呼吸链的结尾，有两个末端氧化酶BO_3氧化酶和氰基不敏感氧化酶（CIO），它们与多种原发性脱氢酶的复杂相关性。在这项研究中，我们还通过分析CIO及其功能分析的纯化以及甘油脱氢酶（GLDH）和葡萄糖酸脱氢酶（GADH）的相互作用来研究氧化发酵的功能分析。 1）对CIO分子的HPLC质量分析的EPR分析和CIO缺陷菌株的质膜的光谱分析，血红素分子的HPLC质量分析表明，CIO分子中有三种类型的血红素分子（B558，B595，d）。 2）用Deae-Toyopearl和Hydroxyapatite将耐氰基氧化醇氧化活性从CIO过表达的菌株的细胞膜中溶解，并使用Deae-Toyopearl和Hydroxyapatite分离并纯化BO_3氧化酶和CIO。这种纯化的CIO制剂是SDS-PAGE，显示了53KD的宽带和一个由33KD频段的主带，距Heme d的峰值约为627nm。 3）在酮氨酸酸酯发酵中，建议在CIO缺陷型菌株中提高了五种酮葡萄糖酸盐的生产率，并且2-酮葡萄糖酸酯的产生增加了CIO过表达的菌株。葡萄糖酸氧化反应的氰（叠氮化物）耐药性的比较，涉及两个主要脱氢酶GLDH和GADH，这表明它们的功能分别由BO_3氧化酶和CIO牢固地连接和连接。