酢酸菌キノヘモプロテイン・アルコール脱水素酵素の構造機能変換と呼吸鎖複合体の形成

醋杆菌醌血红素蛋白乙醇脱氢酶的结构功能转换及呼吸链复合物的形成

基本信息

批准号：
17053017
负责人：
松下一信
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Yamaguchi University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1)酢酸菌アルコール脱水素酵素(ADH)のユビキノン(UQ)還元及びユビキノール(UQH_2)酸化反応部位の解析:本酵素に強固に結合しているUQの高親和性部位(QH)とは別に、バルクのUQ及びバルクのUQH_2と反応する低親和性部位がQHの近傍に別々に離れて存在することがキノン特異的阻害剤による阻害実験によって明らになった。また、この結合型キノンがバルクUQ及びUQH2との電子移動反応に介在して機能していること示すEPR解析データも得られている。2)活性型ADHおよび不活性型ADHのX線構造解析:蒸気拡散法で既に活性型と不活性型ADH双方の結晶を得た。その大きさは活性型0.5 x 0.1 x 0.05mm、不活性型0.3 x 0.1 x 0.02mmである。共に赤色・板状の結晶で、正方晶系、空間群I422に属し、格子定数はα=b=241.4,c=307.1Åである。分子量は約14万で、非対称単位中の分子数は1。回折データの分解能は共に3.1-3.5Åである。現在、さらに重原子同型置換体の検索を進めているが、現在までに、本酵素に含まれる4つのヘムc(cI,cII1,cII2,cII3)とPQQはその位置及び相互の関係も明らかになっている。3)酢酸菌呼吸鎖末端バイバスオキシダーゼとADHとの複合体の解析:酢酸菌の呼吸鎖のシアン耐性バイパスオキシダーゼの実体がcio遺伝子であることを明らかにした。加えて、細胞膜から不活性型ADHとCioの複合体に対応するシアン耐性UQH_2酸化活性を可溶化する条件を確立し、ショ糖密度勾配遠心及び通常のカラムクロマトグラフィーによってADH-Cio複合体の分離を試みた。ADH-Cio複合体の単離にはまだ成功していないが、今後、精製酵素からの再構成法ともあわせて、不活性型ADH・cioの呼吸鎖超分子複合体の分離及び再構成を行う。

1）分析乙酸细菌酒精醇脱氢酶（ADH）的泛氨酸酮（UQ）还原和泛纤维醇（UQH_2）氧化位点：具有奎因酮特异性抑制剂的抑制实验表明，除了与uq的高亲和力（qH）相比，与uq and inz unients usq ulq ulq ulq ulq and superq ulq and inz superq ulq and s useq and s useq and s useq usq usq usq use之间均未反应。分别存在于QH附近。此外，已经获得了EPR分析数据，表明该结合的喹酮功能在电子转移反应中与大量UQ和UQH2。 2）主动和非活动性ADH的X射线结构分析：已经通过蒸气扩散获得了活性和无活性ADH晶体。它的尺寸为0.5 x 0.1 x 0.05mm活跃，0.3 x 0.1 x 0.02mm非活性。两者都是红色和板状晶体，属于四方系统和空间组I422，晶格常数为α= B = 241.4，C =307.1Å。分子量约为140,000，不对称单位中的分子数为1。两个衍射数据的分辨率为3.1-3.5Å。目前，我们正在继续寻找沉重的原子同构取代，迄今为止，该酶中包含的四个HEMES C（CI，CII1，CII2，CII3）之间的位置和关系也已得到阐明。 3）分析乙酸细菌呼吸链末端BYVAS氧化酶和ADH之间的复合物：我们已经透露，CIO基因是乙酸细菌呼吸道链中抗氰基抗氧化氧化酶。此外，还建立了条件，以溶解与细胞膜无活跃的ADH-CIO复合物相对应的抗氰基抗性的UQH_2氧化活性，并且通过蔗糖密度梯度离心剂分解和常规柱色谱法尝试了ADH-CIO络合物的分离。尽管ADH-CIO复合物尚未成功隔离，但除了从纯化的酶进行重构方法之外，呼吸链超分子的无效ADH-CIO的超分子复合物将被分离并重新建立。